养殖水环境的日趋恶化已成为制约我国水产养殖业发展的重要因素,而对于养殖业来说,亚硝酸盐的的积累所造成的危害更甚,严重制约了水产经济的发展。生物反硝化法是理论上解决水体氮污染的有效方法。本课题是以本实验室分离到的一株腊样芽胞杆菌DNF409为原始出发菌株,该菌株具有极强的反硝化能力,能在72h内将硝酸盐污染水体中的硝酸盐,从40μg/mL的浓度降为5μg/mL以下。但在污水处理过程中存在着亚硝酸盐严重积累的现象。课题目的是将该菌株中硝酸还原酶基因,通过分子生物学手段将其敲除,成为专一降解亚硝酸盐菌株。具体研究结果如下:(1)利用E.coli与Bacillus sp.的穿梭质粒Pdg646,构建了基因敲除载体pDGLSR-Ts,它携带有两个长度分别为1 kb、920bp且与narGHIJ基因序列方向完全相同的同源臂Larm和R arm,然后在两段同源臂之间利用酶切插入可在菌株DNF409中表达的抗性片段Sm~r/Spc~r,同时载体部分含有可在菌株中DNF409表达的抗性标记kan~r,且带有一个温度敏感型的复制子,便于重组子的筛选。(2)将narG基因中断载体pDGLSR-Ts电激转化至反硝化菌DNF409中,经过抗性筛选得到表型为Sm~rKan~s的narGHIJ部分基因敲除双交换菌株,并通过PCR分析证实narGHIJ部分基因已经在正确位置通过双交换实现敲除。(3)双交换敲除菌株接入富含硝酸盐及亚硝酸盐的模拟污水中进行反硝化作用实验,发现ZL150硝酸盐的还原能力相比DNF409下降了70%,但发现其对亚硝酸盐的还原能力同时也降低了50%。