论文部分内容阅读
miRNA参与基因转录表达调控,在动物生长发育、激素分泌和乳汁分泌等生理过程中发挥重要作用。乳腺是哺乳动物的泌乳器官。泌乳性状是奶山羊最重要的经济性状,与乳腺组织紧密相关。为此,本研究利用新一代高通量测序、定量PCR、基因克隆以及细胞转染等实验技术结合生物信息学分析来筛选奶山羊泌乳相关miRNA,并对候选miRNA做进一步的功能研究。内容包括构建奶山羊乳腺组织小RNA文库,鉴定泌乳高峰期和干奶期乳腺组织中保守miRNA和新miRNA,筛选这两个时期乳腺组织中差异表达的miRNA并进行组织表达谱分析,验证miR-2478的靶基因及其调控靶基因的机制,最后还研究了候选miRNA和PrRP基因遗传变异效应,本研究主要取得了以下结果：1、奶山羊乳腺组织小RNA测序及miRNA的鉴定分析利用新一代高通量测序技术构建了西农萨能奶山羊泌乳高峰期与干奶期乳腺组织的小RNA文库,分别得到大于18nt的clean读数15,712,891和14,851,375条。在长度分布上,21-23nt的小RNA序列数在干奶期乳腺组织中占总序列数的70%以上,而在泌乳高峰期乳腺组织库中占总序列数的约40%。共鉴定了346个保守成熟miRNA和95个新miRNA。其中,泌乳高峰期乳腺组织中发现了303个保守miRNA和54个新]miRNA,在干奶期乳腺组织中发现了337个保守miRNA和76个新miRNA。在总数、长度分布和种类上乳峰期与干奶期乳腺组织小RNA有显著的差异。表明miRNA在乳腺组织中有明显的时序性和动态变化。2、奶山羊乳腺组织miRNA的验证分析利用PCR和stem-loop PCR的方法分别对山羊miRNA前体序列和miRNA成熟体进一步克隆验证。克隆了随机选取的20个保守miRNA和9个高表达的新miRNA。结果表明牛和山羊的miRNA成熟体和前体序列高度保守。序列和结构的高度同源表明miRNA的功能在同源物种间也可能相似或相同。同时也表明以牛的基因组和miRNA数据库为参考分析山羊乳腺组织中的miRNA是可行的。3、泌乳生理相关miRNA的筛选、表达谱及功能分析与干奶期乳腺组织中miRNA相比,在泌乳高峰期乳腺组织中共筛选出169个差异表达的保守miRNA,其中显著下调的有161个,显著上调的有8个。利用实时定量PCR对13个保守miRNA和9个新miRNA进行组织表达谱分析,保守miRNA没有明显的组织特异性,且大都在肌肉和肝脏中也高表达。而新miR12呈现乳腺组织特异性。与其它物种的miRNA数据比较分析发现,let-7家族的miRNA几乎在所有物种中都高丰度表达。miR-21, miR-30a, miR-101, miR-103, miR-107和miR-148a在人、小鼠、鸡、猪和牛中序列高度保守且都以高丰度表达。乳腺组织中miRNA与乳汁中miRNA的比较结果表明：两者的miRNA有近一半是相同的且多与免疫相关。我们推测乳汁中与免疫相关的miRNA可能是由乳腺上皮细胞主动分泌到泌汁中,从而为新生个体的免疫系统发育提供调节因子。预测的靶基因GO和KEGG分析表明乳腺中miRNA的靶基因主要涉及了胰岛素信号转导通路、JAK-STAT信号转导通路、TGFβ信号转导通路、mTOR信号通路和MAPK通路上等能量代谢、泌乳生理和乳蛋白合成相关的信号通路。并高度富集到细胞分裂、代谢、生物学调节、发育和解剖结构发育等过程。4、miR-2478靶基因的预测与验证分析利用生物信息学方法预测了miR-2478的靶基因,并筛选了SRA1、FBXO11、NCOR1、 TGFβ1、ING4.ING2和INSR等7个潜在的靶基因,克隆相应山羊基因分析发现FBXO11、 TGFβ1、ING4和INSR基因上靶位点序列与参考序列相同。对这4个靶基因进一步双荧光素酶报告检测系统检测,结果表明miR-2478的模拟物只与预测的TGFβ1基因的5’UTR为靶位点发生作用,且预测的TGFβ1基因上靶位点缺失后调节效应也相应解除。结果表明,TGFβ1基因是miR-2478的靶基因。5、miR-2478对TGFβ1基因调控机制分析对TGFβ1基因的启动子实验分析表明该基因有两个主要的转录活性区,分别位于904～-690bp和-79～+197bp。通过生物信息学预测的启动子区域与试验得到的结论基本重叠,进一步分析发现-904～-690和-79～+197bp区域中存在丰富的转录因子结合位点,并且这两个区域存在长约850bp的CpG岛。miR-2478的作用在TGFβ1基因下游启动子区(Downstream Promoter Element, DPE),此外miR-2478的种子区与靶序列结合位点TGGG处存在一个转录因子RBPJ的结合位点。表明miR-2478是通过作用TGFβ1基因下游启子区来调控该基因的转录表达。6、泌乳相关miRNA和靶基因遗传变异分析利用DNA池测序的方法扫瞄了20个miRNA遗传变异,发现了miR-431的-217位C>T的突变,miR-196a的107位C>T的突变和miR-2478成熟体上12-13位CT缺失突变。其中,miR-431的TT基因的个体第三胎泌乳量显著高于其它个体的(P<0.05),miR-196a的第二,三胎杂合型个体的泌乳量显著高于TT基因型个体的(P<0.05)。通过体外实验表明：miR-2478成熟体上两个碱基“UC”缺失,降低了与靶基因TGFβ1的作用效应,但突变后仍有一定的调控作用。此外,还发现4个PrRP基因多态位点,1150G>A,1242T>C,1413A>G和1677indel22bp,其中1242T>C,1413A>G处于完全连锁状态。单倍型HlHl对体长和胸围影响有极其显著正效应(P<0.01)。单倍型H1H1可以作为一个分子标记进一步应用于奶山羊的育种实践中。