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啤酒糟是啤酒工业的主要副产物,长期以来,我国啤酒厂生产过后的啤酒糟大多以做粗饲料为主,收益甚微。这样单一的处理方式既是对资源的极大浪费,也容易造成环境污染,因此越来越多的人开始关注啤酒糟的综合开发利用方式,以提高其经济效益和环境效益。啤酒糟中含有丰富的大分子蛋白质,以其为原料制备蛋白及活性多肽能够显著提高啤酒糟应用价值。本文以啤酒糟为原料,酶解制备啤酒糟多肽,从中分离纯化出具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的活性多肽,并对该组分的稳定性、分子结构及与酶的相互作用等方面进行深入的探讨,具体研究结果如下:(1)采用截留分子量为10kDa和5kDa的超滤膜对啤酒糟粗多肽进行分级分离,分子量小于5kDa的组分具有最高的α-葡萄糖苷酶抑制活性。随后将该组分依次通过Sephadex LH-20凝胶色谱柱、Mono Q阴离子交换柱进行进一步的分离纯化。利用Sephadex G-10凝胶层析柱对收集到的组分进行脱盐和二次分离,所得组分Da-1在体系浓度为325ug/mL时,对酶活的抑制率为47.5%,具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制作用。反相高效液相色谱分析表明,Da-1组分成分单一,符合纯化要求,为目标产物。(2)稳定性测试结果表明,啤酒糟多肽抑制剂在37℃的水浴锅中保温3h后,多肽含量的保留率为88.7%,抑制活性保留率为84.8%,具有良好的稳定性。但其稳定性随着温度的升高而不断降低。啤酒糟多肽抑制剂在pH值为5.0到9.0的范围内能保持较好的抑制效果,强酸强碱条件对其活性有明显的影响,当pH值为2.0时,α-葡萄糖苷酶抑制活性保留率为81.3%;而pH值为12.0时,抑制活性保留率为54.9%。啤酒糟多肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性随着紫外光照时间的延长而略有减小,在经过紫外光照处理4h后,抑制活性保留率为84.6%。在人工胃液中处理3h后,样品的多肽保留率和抑制活性保留率分别为84.0%和81.5%;啤酒糟多肽对胰蛋白酶较为敏感,在人工肠液中处理3h后,多肽相对含量为初始的73.1%,抑制活性的保留率为65.7%。(3)结合LC-MS和氨基酸N端测序的结果发现,分离纯化得到的多肽组分Da-1是一个五肽,分子量为560.2Da,其氨基酸序列为Ser-Pro-Asp-Arg-Ser。(4)荧光光谱测试结果表明,啤酒糟多肽抑制剂对α-葡萄糖苷酶有荧光猝灭现象,且该过程为单一的静态猝灭过程。在不同温度下,该多肽与α-葡萄糖苷酶结合过程的解离常数均为10-4数量级,两者之间具有较好的结合作用。该多肽与α-葡萄糖苷酶可形成一个结合位点,结合位点数均随温度升高而略有增大。(5)利用分子对接技术分析该多肽与α-葡萄糖苷酶的结合作用发现,小分子多肽可以进入α-葡萄糖苷酶的活性口袋,深入酶的催化活性中心,该多肽可以通过与α-葡萄糖苷酶活性中心的钙离子及周围多个氨基酸残基产生相互作用,占据了α-葡萄糖苷酶的活性中心,从而产生抑制效果。