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甘氨胆酸(Glycocholic Acid,GCA)是结合型胆汁酸的一种,广泛存在于牛胆汁中,是牛胆汁中的主要成分之一,具有很高的药用价值。本研究旨在小试试验的基础上,建立从牛胆汁中提取纯化GCA的中试工艺技术路线并建立GCA的LC-MS/MS检测方法。主要研究内容与结果如下:(1)采用除蛋白、浓缩、盐析、萃取以及层析柱等方法,在中试规模的条件下,建立从牛胆汁中提取纯化GCA的中试工艺技术路线。结果:每2 L牛胆汁中GCA的平均提取量为5.98±0.33 g,平均纯度为94.42±5.14%。平均回收率79.42±5.38%。(2)建立GCA的LC-MS/MS检测方法,色谱条件:采用Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×100 mm,2.7 μm)色谱柱;柱温:42℃;进样量:1 μL;流速:0.5 mL·min-1;以色谱级甲醇溶液为流动相。质谱条件:离子源:电喷雾离子源(ESI);质谱扫描方式:多反应监测模式(MRM),负离子化模式(Negtive)检测;雾化气压力4,500V;辅助加热气压力3,500V(-);扫描范围(10-1000);干燥气体氮气;干燥气流量12 L·min-1;干燥气体温度350℃;外标法测定含量。结果显示:GCA三个浓度日内精密度RSD≤6.54%,三个浓度日间精密度RSD≤3.35%,在三个不同温度下甘氨胆酸的稳定性RSD≤7.82%,平均加样回收率为103.24%。检测限为2ng/mL,定量限为10ng/mL。结论:本研究与同工艺的小试试验相比较,从牛胆汁中提取出GCA的提取量、纯度及平均回收率均略低于小试。该提取工艺具有生产周期短,成本低、稳定的特点,已具备了工业化生产的条件。所建立的LC-MS/MS方法在准确度、灵敏度及稳定性等方面均能够满足GCA的定性和定量检测的要求。