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研究背景:病毒性心肌炎（Viral myocarditis,VMC）是一种严重危害人类生命的临床疾病,通常由柯萨奇B3病毒（Coxsackie virus 3,CVB3）引起。VMC的特征是病毒侵袭本身导致的心肌损伤和过度激活的炎症反应导致的炎症性损伤。近年来,随着对VMC发病机制的研究不断深入,许多用于治疗VMC的药物被提出,但均有其局限性。因此,寻找新的治疗VMC的方法仍是目前研究的重要任务。诸多研究证明氧化应激反应的激活是VMC及细胞损伤发生的重要环节,以多种信号通路参与导致的活性氧及其相关代谢产物的累积为特征。过度的氧化应激反应可导致严重的细胞破坏及组织损伤。因而,调控氧化应激反应很可能是延缓病毒性心肌炎损伤的重要手段。芍药苷（Paeoniflorin,PF）是一种单萜苷化合物,在多种免疫及炎症性疾病中均发挥保护作用。多项研究证实PF通过激活Nrf2/HO1信号通路抑制氧化应激反应来保护细胞。研究证实Nrf2/HO1通路在氧化应激反应的动态平衡中起着重要的调节作用。然而,PF对VMC是否具有治疗作用以及Nrf2/HO1通路是否参与其中尚需要进一步研究。因此,我们提出假设:PF通过激活Nrf2/HO1通路来抑制CVB3导致的心肌细胞内氧化应激反应从而缓解心肌损伤。实验目的:1.使用PF干预CVB3感染的H9C2细胞模型,观察PF对CVB3所致的H9C2细胞损伤的影响。2.使用PF干预CVB3感染的H9C2细胞损伤模型,观察PF对CVB3所致的H9C2细胞内氧化应激的影响。3.通过对Nrf2/HO1信号通路中相关蛋白的检测,评估Nrf2/HO1信号通路的激活程度。4.通过Nrf2 SiRNA的转染,明确Nrf2/HO1信号通路是否在PF对CVB3感染所致H9C2细胞损伤的影响过程中发挥重要作用,阐明PF减轻CVB3所致H9C2细胞氧化应激损伤的作用机制。实验方法:1.H9C2细胞培养及分组1.1根据不同PF浓度梯度,将H9C2细胞分为:对照组（CON组）、单纯低浓度药物组（L-PF组,1μmol/L）、单纯中浓度药物组（M-PF组,10μmol/L）、单纯高浓度药物组（H-PF组,100μmol/L）、病毒组（CVB3组）、低浓度实验组（CVB3+L-PF组,1μmol/L）、中浓度实验组（CVB3+M-PF 组,10μmol/L）、高浓度实验组（CVB3+H-PF组,100μmol/L）,评估各组细胞存活情况,选取最佳实验条件。1.2根据步骤1.1中最佳实验条件,采用SiRNA干扰技术,进一步将H9C2细胞分为:实验组（CVB3+PF组）、Si-RNA对照组（CVB3+PF+Scr-SiRNA 组）、Nrf2 小干扰组（CVB3+PF+Nrf2-SiRNA 组）。2.各组细胞活性检测收集步骤1中各组细胞,检测各组细胞CCK8,计算各组细胞存活率。收集步骤1中各组细胞培养基上清,采用ELISA法检测各组细胞LDH水平,评估各组细胞损伤程度。3.各组细胞氧化应激水平检测收集步骤1中各组细胞,应用荧光探针（DCFH-DA）检测各组细胞活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,测定各组细胞丙二醛（Malondialdehyde,MDA）以及还原型谷胱甘肽（Reduced Glutathione,GSH）水平,评估各组细胞氧化应激反应强度。4.各组细胞Nrf2/HO1信号通路蛋白表达水平收集步骤1中各组细胞,分别通过qRT-PCR及Western blot检测E2相关因子2（Nrf2）、血红素加氧酶1（HO1）和NAD（P）H奎宁氧化还原酶1（NQO1）mRNA及蛋白的水平。5.统计分析所有实验结果均以均数±标准差（SEM）（x±s）来表示,应用SPSS 21.0 软件（美国 SPSS Inc.公司）和 GraphPad Prism 9.0 软件（美国San Diego公司）进行分析。采用单因素方差分析（ANOVA）行组间比较。P＜0.05为差异有统计学意义。实验结果:1.PF减轻CVB3所致H9C2细胞损伤,提高细胞存活率与对照组细胞相比,病毒组细胞存活率显著下降（P＜0.0001）,LDH含量升高（P＜0.0001）;PF呈浓度依赖性提高细胞存活率（CVB3+L-PF组 vsCVB3+M-PF 组,P＜0.0001;CVB3+M-PF 组 vsCVB3+H-PF 组,P＜0.05）,高浓度实验组细胞存活率提升最显著。与实验组细胞相比,Nrf2小干扰组细胞存活率显著降低（P＜0.0001）。2.PF减轻CVB3所致H9C2细胞氧化应激与对照组细胞相比,病毒组细胞ROS（P＜0.001）和MDA（P＜0.0001）的含量显著增高,GSH（P＜0.0001）的含量则明显降低;实验组可降低病毒所致ROS（P＜0.001）和MDA（P＜0.0001）含量的增高,升高GSH（P＜0.01）的含量。Nrf2 小干扰组细胞中 ROS（P＜0.01）和 MDA（P＜0.01）含量增高,GSH（P＜0.0001）的含量降低。3.PF激活Nrf2/HO1信号通路减轻CVB3所致H9C2细胞损伤与对照组细胞相比,病毒组细胞Nrf2（protein,P＜0.05;mRNA,P＜0.0001）、HO1（protein,P＜0.001;mRNA,P＜0.0001）、NQO1（protein,P＜0.001;mRNA,P＜0.001）、pNrf2（protein,P＜0.0001）的蛋白及 mRNA表达水平显著下降;实验组可逆转病毒所致Nrf2（protein,P＜0.05;mRNA,P＜0.0001）、HO1（protein,P＜0.05;mRNA,P＜0.001）、NQO1（protein,P＜0.05;mRNA,P＜0.001）、pNrf2（protein,P＜0.01）的 mRNA 及蛋白表达水平的下降。Nrf2小干扰组细胞中Nrf2（protein,P＜0.01;mRNA,P＜0.001）、HO1（protein,P＜0.01;mRNA,P＜0.05）、NQO1（protein,P＜0.01;mRNA,P＜0.05）、pNrf2（protein,P＜0.001）的蛋白及 mRNA表达水平较实验组明显降低。实验结论:1.PF显著减轻CVB3所致的H9C2细胞损伤,显著提高H9C2细胞存活率。2.PF通过激活Nrf2/HO1信号通路抑制H9C2细胞中CVB3所致的氧化应激反应。