天然虾青素是目前发现的最强抗氧化剂,并且是唯一的第四代抗氧化剂,其抗氧化活性是番茄红素、β-胡萝卜素、硫辛酸、叶黄素和维生素E的十倍甚至百倍以上。具有预防或治疗糖尿病、心血管疾病、抗肿瘤和提高免疫力等诸多生物功能,在食品、保健品、制药、化妆品和饲料等行业有着广阔的市场前景和经济价值。但是我国目前缺少具有自主知识产权的高产虾青素菌株,并且虾青素的代谢调控机制不明确,限制了虾青素的应用。红法夫酵母作为生产天然虾青素的微生物候选菌种具有不需要光照,能够代谢多种糖类并快速生长等优点。本研究经筛选获得一株高产虾青素的红法夫酵母菌株PR106,并对其进行了全基因组测序、重测序和遗传进化分析。然后,对胁迫条件进行筛选,确定500 mg/L TiO2为促进PR106合成虾青素的最佳胁迫条件,通过高通量组学技术以及代谢通量分析确定TiO2提高PR106虾青素产量的作用机制,以期为红法夫酵母虾青素的开发和利用提供理论指导,为发展基因工程方法提高红法夫酵母虾青素产量提供新的思路。本研究的主要内容和结果如下:1.从果园土壤中筛选出高产虾青素的菌株并对其进行分离鉴定,利用第二代高通量测序技术对筛选出的菌株进行全基因组测序。通过重测序和系统发育分析研究菌株的变异情况与遗传进化进程。结果表明,筛选出来的菌株虾青素含量为1.69 mg/g DCW,对该菌株进行了26S r DNA D1/D2测序,经与NCBI数据库中的序列进行比对,发现筛选出的菌株序列与红法夫酵母的相似度高达99.9%,将其命名为红法夫酵母PR106。PR106的基因组大小为16.18 Mb,GC含量为47%,与红法夫酵母CBS7918的基因组相比较,测序深度和覆盖度分别为125.31×和99.41%。系统发育树表明PR106和CBS7918之间的遗传进化关系最接近。PR106与CBS7918和Xden1的分歧时间分别为1.25和1.34 MYA。在PR106中产生了72个扩张基因家族和1128个收缩基因家族。2.以红法夫酵母PR106中虾青素产量为重要指标,筛选提高虾青素产量的胁迫条件,包括不同的活性氧发生剂、金属离子以及乙醇和初始p H值。在确定TiO2为显著提高PR106虾青素产量的胁迫条件后,对PR106的基本参数进行了测定,并对TiO2提高PR106虾青素产的原因进行了初步探讨。结果表明,500 mg/L TiO2为提高PR106虾青素含量的最佳条件,虾青素含量为4.03 mg/g DCW,是对照组的2倍。TiO2胁迫没有显著改变PR106的生物量,但促进了酵母对数期后期以及稳定期的细胞分裂（生物量虽未显著变化,但有所增加）并改变了酵母的细胞形态。TiO2可使酵母培养基中H2O2、O2-和·OH的浓度显著增加。在PR106生长至对数期中期之前,TiO2胁迫使酵母细胞凋亡（与生物量有所降低的结果一致）,随着培养时间的延长,酵母表现出很强的适应性。TiO2胁迫引起酵母细胞内发生氧化应激反应,导致细胞内的ROS水平增加,在酵母的对数期中期,过氧化氢酶活性显著增加。3.培养基中的TiO2首先接触红法夫酵母PR106的细胞壁与细胞膜,通过测定细胞壁的完整性与通透性、细胞膜的完整性与流动性探究TiO2产生的活性氧对PR106细胞结构的影响。然后测定细胞膜组分麦角甾醇和脂肪酸含量的变化,分析其与虾青素含量增加的关系。结果表明,TiO2胁迫并未破坏PR106细胞壁和细胞膜的完整性,但降低了细胞壁的通透性和增加了细胞膜的流动性以抵抗不利的生长环境,并且降低了细胞膜中麦角甾醇含量,增加了油酸、亚油酸和α-亚麻酸含量。并且与对照组相比,TiO2协同油酸使PR106中虾青素含量提高2.75倍,虾青素含量达5.5 mg/g DCW。在TiO2胁迫下,PR106中脂肪酸与虾青素形成的虾青素酯含量显著增加,虾青素酯的最高含量是对照组的2.21倍。虾青素与棕榈酸、硬脂酸呈负相关,且相关性较弱,与油酸、亚油酸、α-亚麻酸呈正相关,其中与亚油酸的相关性最强。4.通过高通量的转录组学和蛋白质组学技术探索TiO2胁迫促进红法夫酵母PR106虾青素合成的机制,建立在TiO2胁迫下PR106的基因转录和蛋白质翻译图谱。并分别使用实时荧光定量PCR和平行反应监测（PRM）技术对转录组学和蛋白质组学结果进行验证,对蛋白质的含量和酶活性进行测定。结果表明,转录组学共发现6个差异表达基因,这些差异表达基因被注释为未表征蛋白、转录因子MEIS1和相关的HOX结构域蛋白、Mfs单糖转运蛋白、未表征蛋白、酸性磷酸酶和逆转录病毒相关的gag-pol多聚蛋白,差异表达倍数分别为3.47、4.05、2.79、2.42、0.48和0.45倍。在GO富集通路中上调基因负责细胞对刺激的反应和DNA结合转录因子活性,下调基因主要与3-植酸酶活性、酸性磷酸酶活性和水解酶活性有关,差异表达基因富集到了硫胺素代谢、核黄素代谢和酵母减数分裂等三个KEGG途径上。实时荧光定量PCR分析发现在TiO2胁迫下PR106中八氢番茄红素脱氢酶基因crt I和虾青素合成酶基因ast的相对表达量没有显著性差异,这与转录组学的结果一致。蛋白质组学结果发现共有3193个蛋白质可定量,差异表达倍数大于1.2倍的蛋白质有61个,其中5个蛋白质上调,56个蛋白质下调。TiO2使PR106中与氧化还原平衡、核糖体翻译过程和离子跨膜转运有关的蛋白质差异表达,差异表达蛋白主要富集在RNA降解途径上。PRM分析TiO2胁迫后PR106中与虾青素合成有关的5个差异表达蛋白（芽位选择蛋白（BUD22）、泛素-40s核糖体蛋白s31融合蛋白、细胞周期控制蛋白、C-4甲基甾醇氧化酶和谷氧还蛋白）分别变化了0.8、0.39、1.2、1.12和0.63倍,并且PRM验证结果与蛋白质组学结果表现出相似的趋势。在酵母生长至稳定期时,TiO2胁迫使非酶抗氧化体系中还原型谷胱甘肽含量显著增加,氧化型谷胱甘肽含量显著降低,总谷胱甘肽含量没有显著性差异。5.通过分析蛋白质翻译后修饰的变化情况和测定红法夫酵母PR106细胞内与虾青素合成相关的酶的活性及代谢产物含量,探究TiO2胁迫PR106后相关代谢调控网络与虾青素合成之间的密切联系。结果表明,在TiO2胁迫下PR106中乙酰化、琥珀酰化、磷酸化、2-羟基异丁基化、泛素化和乳酸化等翻译后修饰与虾青素合成不直接相关。TiO2胁迫后PR106能够迅速利用葡萄糖合成用于细胞生长的初级代谢物,并且使处于对数期前期和中期的PR106中乳酸含量显著降低,但乳酸的添加并不影响PR106虾青素合成。在酵母生长的对数期后期,TiO2胁迫使乙醇含量显著增加,相反,在酵母的稳定期,乙醇含量显著降低。TiO2胁迫显著增加了PR106中丙酮酸脱氢酶、柠檬酸合酶、2-酮戊二酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶和线粒体呼吸链复合物Ⅰ-Ⅴ的酶活性以及乙酰辅酶A含量。碳通量的增加为虾青素合成提供充足底物,有氧呼吸的增强促进了ATP的合成为虾青素合成提供能量。综合以上结果,筛选获得1株高产虾青素的红法夫酵母菌株PR106,虾青素含量达到1.69 mg/g DCW。PR106在进化过程中发生很大的变异,与红法夫酵母CBS7918之间的遗传进化关系最近。500 mg/L TiO2为显著提高PR106虾青素含量的最佳胁迫条件,虾青素含量提高了2倍,为4.03 mg/g DCW。TiO2促进PR106虾青素产量增加不是由于虾青素合成途经中基因转录水平、蛋白质翻译水平的变化和蛋白质翻译后修饰的调控。而是因为TiO2胁迫引起PR106的氧化应激促进虾青素积累以维持氧化还原平衡;增加虾青素前体物质以及削弱虾青素合成分支途径上其他类胡萝卜素的合成;增加虾青素酯含量以解除虾青素的反馈抑制;增加碳通量为虾青素合成提供充足底物;促进酵母进行有氧呼吸以增加ATP的合成,为虾青素合成提供能量。并且TiO2协同油酸胁迫PR106使虾青素含量提高2.75倍,虾青素含量达5.5 mg/g DCW。