前言:发育性髋关节发育不良（DDH）是儿童骨科常见的发育障碍,治疗不当可导致青少年和青年期骨关节炎（OA）。在DDH早期,软骨细胞发生凋亡在促进髋臼软骨退变、加速DDH发展中起重要作用。因此,预防软骨细胞凋亡可能是改善DDH预后的重要策略。WNT1诱导信号通路蛋白2（WISP-2）是结缔组织生长因子/富半胱氨酸61/肾母细胞瘤高表达基因（Nov）等CCN家族成员之一。Masatoshi等报道骨关节炎患者髋关节软骨中WISP-2表达水平明显升高,他们的研究表明WISP-2参与了软骨发育不良和软骨异常。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）是一种配体激活的转录因子,属于核受体超家族,PPARγ可调节脂质代谢和细胞凋亡,抑制炎症反应。研究发现WISP-2可抑制3T3L1前脂肪细胞和NIH3T3成纤维细胞中PPARγ的表达和活化。我们推测WISP-2可能通过抑制PPARγ在软骨细胞中的表达和活化而发挥其促凋亡作用。许多研究和临床报告表明,传统的襁褓仍然在许多文化中存在。下肢完全伸展并包裹在一起会导致髋关节半脱位和脱位。本实验观察了新生大鼠模型髋臼和股骨近端骨骺软骨细胞凋亡,并测定了模型中WISP-2和PPARγ的表达。然后在体外培养的原代软骨细胞中,通过WISP-2和PPARγ基因过表达或敲除进一步研究WISP-2是否可能通过PPARγ在软骨细胞中发挥促凋亡作用。本研究为了解DDH的发生机制提供了新的思路。材料和方法:1实验材料1.1实验动物新生Wistar大鼠,由长生生物科技公司提供。动物实验按照《实验动物护理和使用指南》进行。1.2主要实验试剂DMEM购于Hyclone（South Logan,UT,美国）。AGE购于Biovision（2221,Milpitas,CA,美国）。PPARγ（16643-1-AP）,抗体购于Proteintech（武汉）。WISP-2（A7456,A12541）抗体购于爱博泰克生物科技（武汉）,Hoechst染色试剂盒（C0003）购于Beyotime（上海）。TUNEL试剂盒（WL029a）和凋亡检测试剂盒（WLA002a）购于Wanleibio（沈阳）。番红O购于Solarbio（G2540,北京）。3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromide（MTT）购于Sigma（St.Louis,MO,美国）。外科医用胶带（3M Durapore,St.Paul,Minnesota）。2、实验方法2.1动物建模如我们之前论文中报道的那样,在Wistar新生大鼠中建立DDH模型,即DDH模型是用医用胶布固定后腿于髋关节内收和伸直位2天和8天建立的。对照组新生幼鼠正常饲养,不作特殊处理。固定后第2天和第8天,随机对大鼠实施安乐死（200 mg/kg戊巴比妥钠）,切取完整的髋臼和股骨头,并进行后续实验。2.2基因芯片分析对后肢固定8天DDH和健康对照组大鼠髋臼软骨的基因表达谱进行了分析,并在上海生物技术公司进行了实验。在特征提取软件10.7（Agilent technologies）进行数据提取后,原始数据通过分位数算法和GeneSpring软件12.6.1进行归一化。差异表达基因通过差异倍数鉴定,P值用t检验和差异倍数基因（FC）≥±2差异表达计算,P值<0.05。2.3番红O染色在4%多聚甲醛固定后,将髋臼和股骨头组织石蜡包埋,切成5μm切片。切片脱蜡、复水,苏木精溶液染色2分钟,冲洗后再用番红O染色2分钟,显微镜下观察髋臼顶及股骨头负重区,200倍放大拍摄图像。2.4软骨细胞原代培养慢病毒转染从新生大鼠髋臼软骨和股骨头骨骺分离软骨细胞。在含5%CO2的37℃加湿环境中培养。将培养的软骨细胞（第3代）收集并接种到6孔板中。为了上调和下调WISP-2或PPARγ的表达,用携带质粒为WISP-2或PPARγ的过表达（OE）或敲除（shRNA）的慢病毒转染培养的软骨细胞。72小时后,收集细胞进行后续实验。为探讨WISP-2对细胞凋亡的影响,对转染了WISP-2shRNAs的软骨细胞在转染72h后进行了200μg/ml的AGE处理以诱导凋亡。2.5 RT-qPCR从软骨细胞中提取总RNA,反转录成cDNA。RT-qPCR引物序列见文中表1。扩增条件为:扩增条件为:首先在94℃保温5min,然后在94℃保温10s/60℃保温20s/72℃保温30s模式下进行40次循环,72℃保温2.5min,40℃保温1.5min,从60℃融化至94℃,1℃/s,mRNA水平归一为β-actin,用2-ΔΔCt法计算相对mRNA水平。2.6蛋白印迹（Western blot）Western blot检测WISP-2、PPARγ、Zfp423和凋亡相关蛋白的蛋白水平。用RIPA裂解缓冲液提取总蛋白,用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。通过凝胶电泳分离等量蛋白质,用ECL底物检测靶条带。利用凝胶图像处理系统（gel-Pro分析仪软件）分析谱带的光密度。2.7 TUNEL检测;免疫荧光;MTT检测;（Annexin V&PI）双染色法流式细胞术;Hoechst染色。按常规实验方法进行,论文中有详细步骤。结果:1基因芯片结果发现髋关节软骨上调基因共246个。其中104个上调基因中的8个和142个下调基因中的8个被列为研究对象。WISP-2和PPARγ在DDH的早期表达变化提示WISP-2和PPARγ可能是DDH启动的重要因素。2番红O染色及大体测量及检测第8天的DDH组幼鼠髋臼和股骨头的大小明显减小,表现为浅髋臼,髋臼和股骨头的长轴和短轴均变短。番红O染色显示髋臼及股骨头软骨退化表现,细胞凋亡显著增加。RT-qPCR检测WISP-2和PPARγ的相对mRNA水平,发现第2天及第8天股骨头及髋臼中,WISP-2显著增加而PPARγ降低。3 WISP-2过表达诱导软骨细胞凋亡从髋臼软骨中分离出软骨细胞进行原代培养,并用CD44抗体和II型胶原抗体进行免疫荧光鉴定软骨细胞特征。我们检测了软骨细胞标志物、脂肪细胞标志物、纤维细胞标志物的mRNA表达水平,结果表明单纯慢病毒感染并不影响原代软骨细胞的凋亡。转染后,WISP-2在mRNA水平和蛋白质水平上都被上调了。WISP-2的过度表达显著降低了软骨细胞的活性,凋亡细胞比例增加,细胞有明显的核固缩。Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、CleavedPARP和Bax的水平均显著增加。4 WISP-2干扰后抑制由AGE诱导的细胞凋亡WISP-2 shRNA转染后,WISP-2的mRNA和蛋白水平亦显著降低,WISP-2沉默增强了因AGE而降低的细胞活力,同时减少了软骨细胞凋亡。通过沉默WISP-2降低了由AGE引起的Cleaved PARP升高水平。5 WISP-2调节软骨细胞凋亡过程中PPARγ的表达在WISP-2过度表达时,PPARγ的蛋白水平显著降低。AGE处理后,软骨细胞中PPARγ的水平显著降低,沉默WISP-2后,PPARγ的水平部分恢复,PPARγ阳性细胞数减少,而核内PPARγ增多。6 PPARγ减弱WISP-2对软骨细胞活力和凋亡的影响转染后,在PPARγ基因敲除细胞中PPARγ的mRNA和蛋白水平降低,PPARγ过表达细胞中PPARγ的mRNA和蛋白水平升高。PPARγ的敲除可明显抑制软骨细胞的活力,促进软骨细胞凋亡。PPARγ的过度表达降低了因WISP-2过度表达诱导的软骨细胞凋亡,增强了降低了的细胞活力和Cleaved PARP和Bax的蛋白水平。WISP-2主要表达在软骨细胞的细胞质中,与PPARγ的关键转录激活子Zfp423负相关。结论:DDH模型大鼠髋臼及股骨头发育落后,凋亡增加,WISP-2在DDH模型大鼠髋关节软骨中表达上调,同时PPARγ表达下调。体外细胞实验中,过表达WISP-2可导致软骨细胞过度凋亡,同时抑制PPARγ表达;干扰WISP-2表达后,可减轻由AGE诱导的细胞凋亡,同时PPARγ表达增加。过表达PPARγ,亦可减轻WISP-2诱导的凋亡。即WISP-2通过调节PPARγ的表达诱导软骨细胞过度凋亡,可能是DDH中关节软骨病理改变的分子机制之一。