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研究目的探究成熟红细胞正常代谢过程中功能随细胞天龄增加而呈现的变化规律,明确红细胞天龄与功能的相互关系,为进一步研究红细胞在保存过程中随保存时间的延长其功能变化规律、明确不同保存时间红细胞的功能剂量、实现红细胞量化输注、为提高红细胞输注的治疗效果提供实验数据。研究方法1.用非连续密度梯度分离法分离全血红细胞：通过正交设计和多元回归方程分析影响分离效果的各因素,优化离心条件。2.用分光光度法和流式细胞术测定红细胞天龄：用前面建立优化的方法将新鲜全血标本离心分离为6个不同密度层次(1.085,1.088,1.089,1.091,1.092,1.094g/ml)的红细胞部分,测定不同层次红细胞内丙酮酸激酶活性,通过各部分丙酮酸激酶活性与全血红细胞丙酮酸激酶活性的比值(Ratio)推测各部分红细胞平均天龄；测定各部分红细胞膜表面磷脂酰丝氨酸(PS)表达阳性率,来反映红细胞密度与衰老(天龄)的相关性。3.红细胞功能的检测：用流式细胞仪技术检测各分层红细胞膜表面CR1受体的表达情况；用红细胞自然免疫粘附肿瘤细胞试验检测各分层红细胞膜CR1受体粘附肿瘤细胞的活性；用分光光度法测定各分层红细胞内2,3-DPG浓度来初步评价红细胞的携氧能力。研究结果1、结果表明离心力大小、离心时间、标本红细胞平均体积、待分离标本红细胞浓度、个体年龄等因素均对分离结果有影响,其中平均红细胞体积(MCV)的影响起主导作用。在离心条件的选择上,根据分离效果将分离条件定为3500g,20min,4℃。分离后的各分层红细胞,从低密度层至高密度层,其平均红细胞体积(MCV)逐渐减小(94.9±3.8fl-87.2+1.5fl),下降了8.11%；平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)呈递增趋势(282.5±17.9g/l-316.0±23.7g/l),增加了11.86%。2、数据提示随着红细胞密度的增加,PS表达阳性率也逐渐增高；结合红细胞PK比值评价,各分层红细胞平均天龄由低密度层至高密度层依次为11.5、46.0、63.8、74.6、80.5、102.2 d。3、各天龄段红细胞相关功能检测结果显示：1)各分层红细胞(从低密度层至高密度层)细胞膜上CRl受体表达阳性率从73.71±13.62%减少至49.13±21.40%；2)红细胞自然免疫粘附肿瘤细胞试验花环率从61.0±11.7%减至27.0±8.2%；3)100个红细胞中CD35分子表达阳性细胞数(CD35+)、CR1受体活性(Er%)及天龄(D)三者之间存在一定的相关性,其具体关系可用公式表示为：Er%=(61.691+0.11×CD35+-0.365×D)/100×100%。4)各分层红细胞2,3-DPG浓度从6.15±0.78下降至3.73±0.48(mmol/L erythrocytes)。研究结论1、红细胞的密度与天龄有着密切相关性。采用非连续密度梯度分离法与丙酮酸激酶活性评价相结合判断红细胞平均天龄,可作为红细胞天龄与功能相关性研究的参考方法。2、红细胞CR1受体表达和活性的变化以及2,3-DPG的变化与红细胞天龄有着密切相关性。3、红细胞天龄与其主要功能(携氧功能和免疫功能)呈负相关。