第一部分妊娠期糖尿病小鼠胰岛素治疗模型的建立及子代表型检测目的:研究妊娠期糖尿病胰岛素治疗子一代小鼠的生长发育以及糖代谢等状况,明确妊娠期糖尿病小鼠血糖控制对子代成年期代谢性疾病患病风险的影响。材料与方法:建立妊娠晚期期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)胰岛素治疗控制血糖模型,孕期连续血糖监测判断GDM血糖控制效果。GDM子一代(GDM-F1)和GDM胰岛素治疗子一代(INS-F1)出生后均由正常哺乳期母鼠进行哺乳至断乳(3周龄)。连续检测对照组(Ctrl-F1)、GDM-D1和INS-F1组子代出生至20周体重;血糖仪检测子代成年后空腹和随机血糖并进行葡萄糖耐量(Glucose tolerance test,GTT)和胰岛素耐量(Insulin tolerance test,ITT)试验;ELISA方法检测空腹胰岛素水平、HOMA-IR值以及葡萄糖注射后小鼠血清胰岛素水平;小鼠全自动分析仪检测血脂;放免法检测血清Leptin水平。子代8周龄开始进行高脂饮食喂养,观察成年后不良饮食习惯暴露对患病风险的影响。体重、血糖、胰岛素、GTT、ITT和血脂等指标检测同前。结果:通过长效和短效胰岛素的联合应用,GDM孕鼠的血糖水平显著降低。Ctrl-F1、INS-F1和GDM-F1小鼠出生体重无明显差异,经过正常哺乳和饮食后,GDM-F1成年后出现体重增加、血脂的异常;在8周龄时GDM-F1出现明显的GTT异常,16周时出现显著的ITT异常,并伴有空腹胰岛素和HOMA-IR值升高,其中雄性子代更为显著。GDM胰岛素治疗后子代肥胖、血脂异常和胰岛素抵抗症状得到显著改善,仅GTT成年后出现轻度异常;体内葡萄注射后GDM-F1和INS-F1雄鼠均显示胰岛素分泌不足。但是,子代成年进行高脂饮食喂养后,GDM胰岛素治疗所带来的保护作用消除。INS-F1高脂饲养后出现体重增加、糖耐量、胰岛素耐量异常,同时伴有空腹胰岛素水平、HOMA-IR值升高和血脂代谢异常;INS-F1雄鼠代谢紊乱更为显著,雌鼠仅表现为体重升高。结论:GDM胰岛素治疗使子一代代谢异常得到显著改善,子代雌鼠从GDM治疗中获得更多益处;成年后高脂饮食暴露显著增加了 GDM治疗子代代谢异常,这些结果提示GDM孕期有效的血糖控制后子代仍存在代谢紊乱的易感性,而成年后的不良饮食习惯能够加大患病风险。第二部分妊娠期糖尿病胰岛素治疗子代胰岛功能及胰岛基因组DNA甲基化状况目的:研究GDM胰岛素治疗后出生子一代小鼠胰岛形态、超微结构和功能;利用DNA甲基化测序技术研究子代小鼠胰岛组织DNA甲基化状况,分析与胰岛细胞发育以及糖尿病发病相关基因的甲基化状态,并筛选导致子代存在代谢疾病易感性的关键性基因。材料与方法:检测子代小鼠成年后胰腺比重;HE染色评估子代小鼠胰岛组织形态;利用胆总管逆行注射胶原酶消化分离成年子代小鼠胰岛组织,投射电镜观察胰岛β细胞内超微结构;离体胰岛组织体外葡萄糖刺激胰岛素释放试验检测胰岛素分泌功能;利用甲基化免疫沉淀技术(MeDIP-seq)检测GDM治疗子代胰岛组织中基因甲基化情况;进一步利用分子生物学技术分析与子代代谢表型相关基因甲基化状态。结果:GDM-F1和INS-F1子代小鼠胰腺/体重比、HE染色观察胰岛组织形态与对照组相比均未有明显改变;投射电镜也未发现GDM-F1和INS-F1胰岛β细胞内超微结构存在显著变化;但GDM-F1和INS-F1胰岛组织体外葡萄糖刺激胰岛素分泌功能受损,其中INS-F1雄鼠表现较雌鼠更为显著。胰岛组织DNA甲基化测序发现,GDM胰岛素治疗雄性子代胰岛组织与对照组相比仍存在异常甲基化修饰状况。在INS-F1雄性小鼠胰岛组织中,1479个高甲基化基因,其中326个基因在GDM-F1胰岛组织中同样显示高甲基化状态;INS子代胰岛中1602个低甲基化基因,其中493个在GDM-F1胰岛中也显示低甲基化状态。生物信息学技术GO和KEGG分析进一步分析发现,INS-F1与GDM-F1小鼠差异甲基化基因重合富集在II型糖尿病通路,重合基因主要编码胰岛β细胞表面ATP敏感钾离子通道Abcc8、L型钙离子通道Cav1.2、T型钙离子通道Cav2.3以及R型钙离子通道Cav3.1,这些离子通道直接参与调控第一时像和第二时像胰岛素分泌。结论:GDM和GDM治疗子代胰岛形态和超微结构未出现明显异常;GDM治疗后子代离体胰岛存在葡萄糖刺激后胰岛素释放功能受损,是导致子代出现糖耐量受损表型的主要原因之一,而雄性子代显著于雌性子代。GDM治疗后子代胰岛组织中胰岛素分泌相关基因未被纠正的异常甲基化修饰,可能是INS-F1子代存在胰岛功能障碍和患病风险的机制之一。第三部分妊娠期糖尿病胰岛素治疗子代胰岛β细胞通道功能、基因表达及DNA甲基化目的:研究GDM胰岛素治疗子代胰岛组织中离子通道基因Abcc8、Cav1.2、Cav2.3和Cav3.1基因表达情况、甲基化状态和通道介导的胰岛素分泌功能,评估GDM治疗后子代胰岛组织通道基因发生甲基化异常的风险,从表观遗传角度探索子代患病易感性。材料与方法:根据MeDIP-seq筛选的目标基因,利用荧光定量PCR和蛋白印记方法检测GDM-F1和INS-F1小鼠胰岛中Abcc8、Cav1.2、Cav2.3和Cav3.1基因表达情况;利用KATP和L型钙离子通道激动剂和拮抗剂处理子代小鼠离体胰岛判断离子通道介导的胰岛素分泌功能;应用焦磷酸测序方法检测子代小鼠胰岛组织中Abcc8、Cav1.2、Cav2.3和Cav3.1基因启动子区域甲基化状况;利用正常胎儿时期小鼠胰岛体外不同葡萄糖培养模拟动物模型来检测甲基化酶Dnmts和去甲基化酶Tets表达情况以及通道基因Abcc8、Cav1.2、Cav2.3基因表达和甲基化状态。收集临床GDM治疗患者和对照病例胎盘胎儿面组织,利用MethylTargetTM技术检测钾离子和钙离子等通道基因DNA甲基化状态。结果:GDM-F1和INS-F1雄性小鼠胰岛组织中Abcc8、Cav1.2、Cav2.3 mRNA和蛋白均表达下降,INS-F1雌性小鼠仅Cav2.3表达下降,Abcc8和Cav1.2未有表达改变;甲基化检测发现Abcc8、Cav1.2和Cav2.3基因启动子区域与对照组相比呈现高甲基化修饰,INS-F1雌性仅Cav2.3基因表现高甲基化状态;其中,Cav1.2基因在子代进行高脂饮食后出现高甲基化修饰伴随表达下调,在GDM-F1和INS-F1子代胰岛中宫内因素合并出生后饮食因素导致Cav1.2表现出更为显著的甲基化修饰和表达改变;KATP抑制剂Tolbutamide处理子代离体胰岛后发现,GDM-F1和INS-F1子代胰岛出现反应性下降胰岛素分泌能力不足;L性钙离子通道激动剂Bay K8644处理胰岛后GDM-F1和INS-F1胰岛出现反应性降低、胰岛素分泌能力下降;进一步,利用正常胎鼠胰岛组织体外短暂高浓度葡萄糖暴露后发现甲基化酶Dnmt1表达升高,去甲基化酶Tet2、Tet3表达下降,通道基因Abcc8、Cov1.2、Cav2.3短暂高糖暴露后亦出现启动子区域的高甲基化改变。临床GDM治疗后胎盘胎儿面组织中钙离子通道基因Cav1.2、Cav1.3、Cav2.3和Cav3.1启动子区域CpG位点甲基化水平与对照组相比仍显示高甲基化状态,而Abcc8基因与对照组相比未出现显著差异。结论:GDM胰岛素治疗后子代胰岛组织离子通道介导的胰岛素分泌功能障碍,可能是导致子代出现糖耐量异常的主要原因之一。通道基因Abcc8、Cav1.2、Cav2.3表达降低可能是胰岛细胞胰岛素分泌受损的机制之一。GDM治疗子代小鼠胰岛中Abcc8、Cav1.2、Cav2.3启动子区域异常的甲基化修饰,从表观遗传角度解释了通道基因表达降低的原因。正常胎鼠体外高糖培养证实了高浓度葡萄糖环境对目标基因DNA高甲基化修饰和表达下调的影响作用。小规模临床样本验证初步提示了GDM治疗后子代通道基因仍存在异常DNA甲基化修饰风险。