引言非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacterium,NTM)是指除了结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌外的所有分枝杆菌菌种。随着获得性免疫缺陷综合征患者和免疫抑制人群的增多,NTM病的发病率和患病率在全球和我国都呈现上升态势,NTM已成为威胁人类健康和生命的重要病原。研究表明NTM在中国的菌种分布有很大的地域差异性,而不同NTM菌种的致病性和药物敏感性差异很大,了解这种多样性对指导临床治疗有至关重要的作用。然而在中国,尤其是在NTM患病率高发地区,NTM流行病学的地域差异性还缺乏系统性数据。对NTM进行菌种鉴定、药物敏感性试验及临床数据的分析,对全面理解NTM的生物学特征及临床诊治方案的制定具有重要意义。本研究在我国较大范围内收集疑似结核感染患者的体液标本,通过传统的生化检验培养出NTM,再通过多靶位基因测序法对上述菌株进行鉴定,分析不同地区NTM菌种分布的差异性,对NTM优势菌种的药物敏感性特点及耐药机制进行了进一步研究,以期为我国NTM流行病学特点和临床治疗决策提供依据。第一部分中国东部和华南地区非结核分枝杆菌的分布特征研究目的:分析我国NTM感染高发地区NTM菌种分布的差异性。方法:收集2012年1月-2014年12来自中国南部的广州胸科医院和中国东部的上海肺科医院的临床NTM分离株。通过对16S rRNA、rpoB、hsp65和16S-23S rRNA基因间隔区(ITS)进行基因测序完成菌种鉴定分析。结果:(1)共连续采集NTM临床分离株1450株。最常见的5种分离株分别是脓肿分枝杆菌复合群(605株,41.7%),鸟胞内分枝杆菌复合群(330株,22.8%),戈登分枝杆菌(244株,16.8%),堪萨斯分枝杆菌(179株,12.3%),偶发分枝杆菌(50株,3.4%)。(2)上海和广州NTM菌种的分布存在差异:其中上海NTM临床分离株共512株,最常见的为鸟胞内分枝杆菌复合群(212株,41.5%)、脓肿分枝杆菌复合群(145株,28.3%)、堪萨斯分枝杆菌(95株,18.6%)。广州NTM临床分离株共938株,最常见的为脓肿分枝杆菌复合群(458株,48.8%)、戈登分枝杆菌(211株,22.5%)、鸟胞内分枝杆菌复合群(118株,12.6%)。第二部分中国堪萨斯分枝杆菌亚型分布和克拉霉素耐药相关性分析研究目的:分析中国患者堪萨斯分枝杆菌亚型分布,并评估不同亚型间的药物敏感性特点。方法:收集2008-2015年间来自国家耐药结核监控中心13个省份的NTM菌株。将鉴定为堪萨斯分枝杆菌的菌株通过限制性片段分析法分为不同亚型,并对不同亚型的堪萨斯分枝杆菌进行体外药敏检测。结果:收集78株堪萨斯分枝杆菌。阿米卡星对堪萨斯分枝杆菌的活性最高,堪萨斯分枝杆菌对不同喹诺酮类药物的敏感性差异大,对左氧氟沙星的耐药性(39.7%)明显高于莫西沙星(16.7%,P=0.001)和加替沙星(19.2%,P =0.005)。对于利福霉素类药物,利福平耐药株的比例明显高于利福布汀耐药株(P=0.006)。78株堪萨斯分枝杆菌经PCR-restriction enzyme analysis(PRA)分析,共得到4个不同的亚型,即亚型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。其中亚型Ⅰ最为常见(56/78,71.8%)。亚型Ⅰ对克拉霉素的耐药率明显高于其它亚型(26.8%;vs4.5%;P=0.031)。在16株对克拉霉素耐药的堪萨斯分枝杆菌中,9(56.2%)株分离株与23S rRNA基因突变有关。第三部分鸟胞内分枝杆菌复合群感染患者临床特征分析及药物敏感性检测研究目的:收集我国结核病专科医院的NTM病患者临床分离的菌株,分析其中鉴定为鸟胞内分枝杆菌复合群患者的临床特征及药物敏感性特点。方法:收集2011-2013年来自于4家结核病专科医院的分枝杆菌菌株,通过对16S rRNA、rpoB、hsp65和ITS进行基因测序完成菌种鉴定。将鉴定为鸟胞内分枝杆菌复合群的菌株进行体外药敏实验并收集相关临床资料。结果:(1)本研究共收集鸟胞内分枝杆菌复合群253株,其中胞内分枝杆菌188株(41.6%),鸟分枝杆菌65株(14.4%)。(2)胞内分枝杆菌肺病患者年龄≥65岁的比率(41.5%)显著高于鸟分枝杆菌肺病患者(23.1%)(OR=2.36,95%CI:1.25～4.46,P=0.008);胞内分枝杆菌肺病患者伴发慢性阻塞性肺疾病者显著高于鸟分枝杆菌肺病患者(OR=2.84,95%CI:1.56～5.19,P=0.001)。(3)克拉霉素、卷曲霉素和利福布汀对鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的活性较好,耐药率均低于5%;而阿奇霉素、左氧氟沙星、加替沙星和链霉素对鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的抗菌效果较差,耐药率均高于70%。(4)鸟分枝杆菌对莫西沙星和利奈唑胺的耐药率显著高于胞内分枝杆菌(10.8%,1.6%,χ2=10.71,P<0.05;40.0%,8.5%,χ2=44.71,P<0.05);鸟分枝杆菌对利福平的耐药率显著低于胞内分枝杆菌(38.5%,66.0%,χ2=9.01,P<0.05)。第四部分综合医院脓肿分枝杆菌的流行情况和抗菌药物敏感性目的:收集了从某综合医院呼吸道标本中分离的脓肿分枝杆菌,分析其药物敏感性特点。方法:收集2012年4月-2015年3月来自北京某综合医院的分枝杆菌菌株,通过对16SrRNA、rpoB、hsp65和ITS进行基因测序完成菌种鉴定。将鉴定为脓肿分枝杆菌的菌株进行进一步药敏测定。所选药物为临床常用于治疗脓肿分枝杆菌复合群感染的13种抗菌药物。结果:(1)本研究共收集了 61个NTM分离株,其中脓肿分枝杆菌的检出率位列第二(22/61,36.1%)。(2)克拉霉素对脓肿分枝杆菌菌株具有高度抗菌活性,其MIC50和MIC90分别为0.06μg/mL和8μg/mL。对于氟喹诺酮类药物,莫西沙星和左氧氟沙星表现出不同的耐药谱,莫西沙星耐药率(6/22,27.3%)显著低于左氧氟沙星(17/22,77.3%)(P<0.01)。(3)所有克拉霉素耐药的脓肿分枝杆菌分离株中均有与克拉霉素耐药相关的23S rRNA突变。结论(1)NTM在中国的菌种分布有明显地域差异,脓肿分枝杆菌主要分布在我国南部,胞内分枝杆菌主要分布在我国东部,这种差异或许反映了 NTM菌种在环境中的分布。(2)我国堪萨斯分枝杆菌的体外药敏检测中,阿米卡星是抗菌活性最高的药物,而克拉霉素的耐药比例较高。在我国堪萨斯分枝杆菌的分子分型中,占优势的亚型I对克拉霉素耐药率明显高于其他亚型。(3)鸟分枝杆菌复合群是我国最常见的NTM之一,且胞内分枝杆菌与鸟分枝杆菌的耐药谱有明显差别。临床中胞内分枝杆菌肺病更易于发生在老年及具有慢性阻塞性肺疾病的患者中。(4)克拉霉素、阿米卡星、利奈唑胺在体外表现出对脓肿分枝杆菌具有较好的抗菌活性,而左氧氟沙星、亚胺培南和磺胺甲恶唑对脓肿分枝杆菌的抗菌活性较差。位于23S rRNA上的基因突变可以用来预测脓肿分枝杆菌是否对克拉霉素耐药。