国际疼痛研究协会将神经病理性疼痛定义为在外周或中枢水平由躯体感觉神经系统的损伤或疾病而直接造成的疼痛,多种类型的组织损伤均可导致病理性疼痛,例如外伤、感染、炎症、化疗、肿瘤、代谢性疾病、放疗等均可直接或间接引起外周或中枢神经系统损伤或功能紊乱,从而诱发神经病理性疼痛。临床主要表现为:异常疼痛、痛觉过敏、自发性疼痛。神经病理性疼痛的发病机制复杂,尚未完全研究清楚,临床上也缺少有效地治疗手段,已经成为疼痛研究中的难点和热点。肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)是一多功能细胞生长因子,具有促进细胞存活、分化、增殖、血管新生、神经营养、抗炎和抗纤维化等生物学活性。但HGF蛋白在血清中的半衰期非常短仅10分钟左右,对其作为药物应用具有很大的局限性。因此,我们构建了携带有卡那霉素抗性基因、CMV启动子、人HGF基因和ployA加尾的真核表达质粒DNA(命名为pUDK-HGF,专利号为ZL00132196.X)。目前,重组质粒pUDK-HGF注射液治疗周围动脉闭塞疾病已经完成了I期临床试验,正在进行临床II期研究。I期临床研究结果表明,在缺血病人肢体局部多点肌肉注射重组质粒pUDK-HGF后最明显及最早出现的疗效是对肢体缺血、溃疡、坏疽等引起疼痛的镇痛作用,并且这种镇痛作用先于血管新生。这启示我们重组质粒pUDK-HGF可能对皮肤、肌肉、神经损伤导致的神经病理性疼痛具有镇痛作用。因此,我们选择了三个不同类型的疼痛模型即足底切口痛、皮肤肌肉切口牵拉痛模型和坐骨神经分支损伤模型用于重组质粒pUDK-HGF的镇痛作用及机制研究。首先,我们对重组质粒pUDK-HGF进行了生产,其生产工艺包括:单批-补料发酵、连续碱裂解及超滤浓缩、三步层析纯化以及产品浓缩分装,该工艺可在一周内完成一个批次的生产。通过该纯化工艺生产,可获得纯度较高的重组质粒pUDK-HGF。成品可用于细胞转染、动物实验等。重组质粒pUDK-HGF转染CHO细胞后48h,人HGF蛋白的表达量为40.5±2.2ng/mL/1×106Cell。转染重组质粒pUDK-HGF的CHO细胞培养上清能促进HUVEC细胞迁移,且细胞迁移数是pUDK空质粒组的3倍,具有显著性差异(P<0.01)。第二,应用切口痛(IP)、皮肤肌肉切口牵拉痛(SMIR)以及坐骨神经分支损伤性(SNI)神经病理性疼痛模型,通过局部肌肉注射或鞘内注射重组质粒pUDK-HGF观察对皮肤、肌肉、神经损伤引起疼痛的镇痛作用。结果显示,在切口痛模型中,局部肌肉注射重组质粒pUDK-HGF后6h对切口损伤引起的自发性疼痛行为及机械缩足阈值、热痛缩足潜伏期的降低都具有显著的改善作用;在smir模型中,通过局部肌肉注射或鞘内注射重组质粒pudk-hgf对smir诱导机械缩足阈值降低都有显著提高,结果表明重组质粒pudk-hgf能抑制外周损伤引起中枢痛敏的形成;在sni模型中,通过鞘内注射重组质粒pudk-hgf对sni诱导的机械缩足阈值和热痛缩足潜伏期都有显著的改善作用,并通过肌肉或鞘内多次注射重组质粒pudk-hgf对sni的镇痛作用可持续52天以上。通过以上研究显示重组质粒pudk-hgf对皮肤、肌肉、神经损伤诱导的疼痛动物行为均有改善作用。第三,通过病理学观察表明,重组质粒pudk-hgf能抑制损伤组织中炎性细胞的浸润,胶原纤维累积;并激活肌卫星细胞,促进损伤肌纤维修复和再生。利用多普勒血流量测定仪检测smir和sni损伤肌肉组织中血流变化情况,结果表明肌肉注射重组质粒pudk-hgf能增加损伤肌肉组织中血流灌注量,而对注射部位以外组织中的血流灌注量无影响。elisa检测结果表明,局部肌肉注射pudk-hgf能抑制pge2、5-ht、his的高表达;同时,重组质粒pudk-hgf抑制损伤肌肉组织中ngf的高表达,起到镇痛作用。通过westernblot技术检测脊髓腰段l3-l5节段小胶质细胞特异性标志物cd11b、星形胶质细胞特异性标志物gfap、天然免疫受体tlr4以及tnf-α表达变化,结果显示肌肉注射重组质粒pudk-hgf后能抑制cd11b、gfap、tlr4和tnf-α表达上调,说明局部创伤修复、炎性因子降低能减少脊髓胶质细胞的活化,并抑制脊髓中炎性因子的释放。通过以上实验结果表明,重组质粒pudk-hgf的外周镇痛作用机制包括:(1)抑制损伤组织中炎性细胞浸润,激活肌卫星细胞,促进损伤组织修复;(2)增加损伤组织局部血流灌注量,改善损伤组织微环境;(3)抑制损伤组织中致痛因子释放,抑制外周疼痛感受器的敏化和兴奋,抑制外周敏化形成;(4)抑制外周伤害性疼痛信号向脊髓中枢的传递,降低脊髓胶质细胞的活化,并抑制脊髓中炎性因子的释放,起到镇痛作用。第四,通过鞘内注射重组质粒pudk-hgf后对脊髓腰段l3-l5节段取材进行westernblot检测,结果表明鞘内注射重组质粒pudk-hgf对脊髓中小胶质细胞特异性标志物cd11b和星形胶质细胞特异性标志物gfap的高表达具有显著的抑制作用。然后,通过体外实验进一步证明rh-hgf蛋白能抑制bv2小胶质细胞形态变化,减少炎性细胞因子il-1β、il-6、tnf-αmrna的表达,并抑制inosmrna的高表达,减少细胞培养上清中no含量。通过以上初步研究表明,重组质粒pudk-hgf的中枢镇痛作用机制包括:(1)通过鞘内注射重组质粒pudk-hgf后在脊柱内脊髓背侧角表达人hgf蛋白,对脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞的激活起抑制作用;(2)hgf蛋白通过抑制小胶质细胞细胞形态变化、特异性标志物Iba1的高表达,抑制小胶质细胞激活;(3)HGF蛋白能抑制活化的小胶质细胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α、NO的表达,起到中枢抗炎的活性,抑制中枢痛敏的形成。通过以上研究表明,重组质粒pUDK-HGF对皮肤、肌肉、神经损伤引起的神经病理性疼痛具有镇痛作用,阐明了重组质粒pUDK-HGF外周及脊髓中枢镇痛作用机制。为扩展重组质粒pUDK-HGF用于术后持续性疼痛、难愈合创面持续性疼痛以及坐骨神经痛等难治性疼痛的基因治疗奠定基础,对临床应用具有现实意义。