论文部分内容阅读
目的：探讨野生型p53基因在不同水平下的对肝癌细胞中POLD1基因表达及细胞恶性表型的影响。方法：设计并构建p53特异性小干扰shRNA绿色荧光真核表达质粒(p53-siRNA)和表达EGFP-p53融合蛋白的p53绿色荧光真核增强表达质粒(pEGFP-p53),通过脂质体Lipofection-2000介导转染,将表达pEGFP-p53重组质粒、p53-siRNA转染入SMMC-7721细胞；经G418筛选,获得稳定细胞系7721-p53、7721-p53RNAi。通过RT-PCR检测转染后p53、POLD1的mRNA表达水平。通过生长曲线测定,克隆形成实验,了解SMMC-7721细胞在p53表达水平改变后细胞恶性的变化。结果：1.高表达野生型p53的人肝癌细胞系SMMC-7721-pEGFP-C1-p53中,p53和POLD1基因的灰度值比为3.24±0.61,而普通肝癌细胞的p53和POLD1灰度值比为0.97±0.11,说明高表达野生型p53的肝癌细胞系较普通人肝癌细胞灰度值比明显增高,两者比较,有统计学意义(P<0.001)。2.低表达野生型p53的人肝癌细胞系SMMC-7721-pGPU6/GFP/neo-p53i-769中,p53和POLD1基因的灰度值比为0.04±0.01,较普通肝癌细胞的p53和POLD1灰度值比为0.97±0.11,说明低表达野生型p53的肝癌细胞系较普通人肝癌细胞灰度值比明显降低,两者比较,有统计学意义(P<0.001)。3.对高表达野生型p53的人肝癌细胞系SMMC-7721-pEGFP-C1-p53,低表达野生型p53的人肝癌细胞系SMMC-7721-pGPU6/GFP/neo-p53i-769,和普通人肝癌细胞SMMC-7721分别进行MTT和平板克隆形成实验。MTT结果发现：SMMC-7721-pGPU6/GFP/neo-p53i-769的细胞其生长速度比普通肝癌细胞的要快,而SMMC-7721-pEGFP-p53的细胞较普通肝癌细胞生长速度较慢。克隆形成实验结果显示：pEGFP-Cl-p53、pGPU6/GFP/neo-p53i-769组克隆形成率分别为38.15±0.33%和72.96±1.80%,与普通肝癌细胞SMMC-7721的克隆形成率50.53±0.15%相比,均有统计学差异(P<0.05)结论：在人肝癌细胞SMMC-7721中,高表达的野生型p53基因能够抑制POLD1的基因转录和细胞增殖活性。低表达野生型p53基因能够促进POLD1的基因转录和细胞增殖活性。