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肌内脂肪组织(大理石花纹)含量较低在中国仍然是提高牛肉产品质量的挑战,大理石花纹含量高的牛肉更受欢迎。因此,增加IMF含量的方法已成为改善肉质的关键方面。因此,对脂肪形成机理的研究为改善肉质提供了宝贵的信息。本研究探究了TORCs及其对牛脂肪细胞脂质代谢的潜在调控机制。TORC基因家族共有三个成员:TORC1,TORC2和TORC3,也称为CRTC[CREB(c AMP反应元件结合蛋白)调节的转录共激活因子]。CREB转录需要TORC,CREB,是一种通用的转录因子,可调节4000多个基因的表达,参与代谢,细胞增殖,分化,免疫应答以及其他生理和病理过程的调控。TORC2基因通过PI3K-Akt,AMPK,胰高血糖素和胰岛素抵抗等信号通路调控营养代谢,糖异生,肌异生和脂肪形成。在本研究中,我们探索了牛脂肪细胞中TORC2基因的功能。我们还通过不同的实验探索了TORC1和TORC2基因的转录和转录后调控,并证实了以下发现。1.PCR扩增产物测序在秦川牛的TORC2基因启动子区域中分别在g.16534694G>A,g.16535011C>T和g.16535044A>T等位点探索了三个新的SNP。这些SNP的等位基因和基因型频率偏离了Hardy-Weinberg平衡(HWE)(P<0.05)。SNP1基因型GG,SNP2基因型CT和SNP3基因型AT表现出显著的(P<0.05)更大的体形和更好的胴体品质性状。在牛前脂肪细胞中,单倍型H1(GCA)显示出显著(p<0.01)较高的转录活性(51.44%),其次是H4(ATT)(34.13%)。HI-H3(GG-CCAT),H1-H2(GG-CT-AT)和H3-H4(GA-CT-TT)双型显示出与体型测量显著相关(P<0.01),并具有更好的胴体品质。2.在本研究中,我们通过细胞周期染色流式细胞仪,细胞计数测定,5-乙炔基-2’-脱氧尿苷染色(Ed U)以及增殖相关m RNA和蛋白质表达分析,证实了TORC2在牛前脂肪细胞增殖中对相关标记基因的作用。此外,油红O染色分析,脂联素的免疫荧光,脂质相关标记基因的m RNA和蛋白水平表达证实了TORC2在调节牛脂肪细胞分化中的作用。此外,在牛脂肪细胞中确定了TORC2基因的转录起始位点和亚细胞定位。为了研究牛TORC2的潜在调控机制,我们将1990 bp的5’非翻译区(5’UTR)启动子区克隆到荧光素酶报告载体中,并通过序列缺失5’UTR侧翼区构建了七个载体片段。在转录起始位点上游-314至-69 bp处鉴定到TORC2基因的核心启动子区域。基于启动子载体片段的转录活性,突变片段的萤光素酶活性和si RNA干扰的结果,四个转录因子(CCAAT/增强子结合蛋白C/BEP?,X-box结合蛋白1 XBP1,胰岛素瘤相关1 INSM1和锌指蛋白263(ZNF263)被鉴定为TORC2基因的转录调节因子。这些发现通过牛脂肪细胞核提取物中的电泳迁移率变动分析(EMSA)得到了进一步证实。此外,我们还鉴定出C/EBP 1,XBP1,INSM1和ZNF263在启动子区域中调节TORC2基因作为活化剂。3.si RNA下调了牛脂肪细胞中的TORC2基因,并进行了RNA测序。TORC2的下调负调控牛脂肪细胞的分化。此外,共发现577个DEG,其中包含146个上调基因和376个下调基因。KEGG通路分析表明,DEGs与神经活性配体-受体相互作用通路,钙信号通路,c AMP通路,趋化因子信号通路和Wnt信号通路相关。DEGs的基因本体(GO)分析表明,TORC2基因的下调显著抑制了调节牛脂肪细胞中与脂肪形成相关过程的重要基因,特别是生物学活性的调节,初级代谢过程的调节,多细胞的调节生物过程,细胞粘附,脂质代谢过程,分泌,化学稳态,运输调节,细胞信号传导,c AMP代谢过程,细胞钙离子稳态,脂肪细胞分化和细胞成熟。4.在本研究中,分析了牛前脂肪细胞中TORC1基因的表达和亚细胞定位。应用生物信息学工具分析TORC1。为了研究牛TORC1基因调控的分子机理,我们将5’UTR调控区的1008 bp克隆到了荧光素酶报告载体中。使用TORC1启动子的5’UTR单向缺失扩增了不同的片段。定点突变,双荧光素酶报告基因测定,RNAi干扰和DNA-蛋白质相互作用(EMSA)用于验证Smad3和NRF1在牛前脂肪细胞中TORC1基因的调控中的调控作用。在转录起始位点上游-410至-155 bp处确定了TORC1基因的核心启动子区域。通过5’UTR侧翼区域的序列缺失构建不同的载体,并结合定点突变和通过si RNA或sh RNA的转录干扰,发现NRF1和Smad3这两个转录因子是TORC1基因启动子的阻遏物。这些发现通过牛脂肪细胞核提取物中的电泳迁移率变动分析(EMSA)得到了进一步证实。在这项研究中指定了TORC1基因的核心启动子区域,其转录起始位点的上游跨度为-410至-155 bp,该信息将为改善牛肌内脂肪的研究提供参考。5.Micro RNA是短链的非编码RNA,已被证明是有效的脂肪形成调节剂。然而,尚不清楚bta-mi R-149-5p在调节牛脂肪形成中的作用,特别是在TORC的调节中。在脂肪形成的不同阶段的表达谱分析表明,bta-mi R-149-5p在增殖阶段以及在牛脂肪细胞分化的第9天都富集。我们的功能研究表明,bta-mi R-149-5p可以负调节牛脂肪细胞的增殖和分化。bta-mi R-149-5p的过表达抑制了m RNA和蛋白质水平上的增殖标记基因的表达,显著降低了S期细胞的百分比,减少了Ed U染色的细胞数量,并显著降低了该细胞中脂肪细胞的增殖活力。细胞计数测定。总的来说,这些发现阐明了btami R-149-5p抑制脂肪细胞的增殖。并且,bta-mi R-149-5p的过表达还抑制了脂肪生成基因在m RNA和蛋白质水平上的表达,抑制了脂质积累,并减少了牛脂肪细胞中脂连蛋白的分泌。此外,萤光素酶活性测定探讨了bta-mi R-149-5p如何直接靶向TORC(TORC1和TORC2)。通过bta-mi R-149-5p过表达下调的TORC1和TORC2的m RNA和蛋白水平表达进一步验证了这种靶向作用。由此可见,bta-mi R-149-5p通过调节关键的转录因子间接靶向TORC1和TORC2。bta-mi R-149-5p的过表达抑制了SMAD3的表达,同时丰富了NRF1的表达,NRF1是关键的转录因子和TORC1的有效调节因子。bta-mi R-149-5p的过表达在m RNA和蛋白质水平上也抑制了TORCs的关键调控因子C/EBPγ,XBP1,INSM1和ZNF263的表达。我们可以得出结论,在秦川牛的品种改良计划中,测序中发现的TORC2 SNP位点可以用于标记辅助选择胴体质量和体形特征。此外,TORC2基因可能是脂肪形成的正调节剂,我们还发现C/EBP?,XBP1,INSM1和ZNF263调节TORC2基因作为启动子区域的激活剂。此外,RNA测序结果还证明TORC2调节牛脂肪细胞中的脂质代谢,并为研究TORC2基因调节脂肪形成的功能和分子机理提供基础。NRF1和Smad3的两个转录因子被发现是牛脂肪形成过程中TORC1基因启动子的阻遏物。除此之外,bta-mi R-149-5p在转录和转录后水平上都是TORC1和TORC2的负调节剂,并且bta-mi R-149-5p可以调节脂肪形成,这意味着bta-mi R-149-5p可能是增加肉牛肌肉内脂肪的目标。这些发现不仅为改善牛肌内脂肪的研究提供了基础,而且还将增进我们对代谢综合征和肥胖症在公共卫生领域的治疗干预的认识。