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背景与目的：食管癌是威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一,严重威胁着人类的健康。大量研究发现,真核细胞翻译起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor4E,eIF4E)在恶性肿瘤的发生及转移行为中的发挥重要作用。eIF4E能特异性地结合mRNA5’端m7GpppN帽子结构,是真核细胞胞质中mRNA翻译有效的限速调节因子,一旦被激活,该基因通过提高许多癌基因相关的生长因子的翻译表达而促进致癌作用。近年来的研究证实,eIF4E在包括食管癌在内的多种人类恶性肿瘤及其癌旁组织中过表达,eIF4E逐渐成为评估和判定食管癌恶性程度的重要基因,调节eIF4E的水平和活性,抑制肿瘤细胞生长,是肿瘤生物治疗学领域的新思路,但目前有关eIF4E与食管癌化疗药物敏感性的作用机制研究报道较少。本研究拟以脂质体为载体转染食管癌EC9706细胞,通过RANi技术调控食管癌EC9706细胞中eIF4E的表达,筛选出稳定表达的食管癌细胞,MTT法研究调控真核细胞翻译起始因子4E的表达探讨与食管癌相关药物敏感性的关系,为进一步探索筛选食管癌的靶向治疗提供依据。方法：1、筛选RNA干扰有效靶点：将eIF4E的过表达质粒PEGFP-N1和eIF4E不同干扰靶点的RNAi病毒载体质粒U6-shRNA-CMV-GFP-1、U6-shRNA-CMV-GFP-2、U6-shRNA-CMV-GFP-3,通过脂质体共转染工具细胞293T细胞,24h后荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况,36h后收集细胞抽提蛋白,采用Western Blot检测eIF4E的表达情况,实验结果通过Leica Application Suite4.0软件进行灰度值分析,通过计算eIF4E与GAPDH的灰度值比值得到各组细胞eIF4E蛋白的相对表达量。判断不同靶点的干扰效果,选择干扰效果最强的RNAi病毒载体质粒用于实验。2、建立eIF4E不同表达水平的稳定转染细胞株：将PEGFP-N1质粒、U6-shRNA-CMV-GFP质粒(筛选出的干扰效果最强的质粒)及阴性对照PEGFP-N1-NC质粒、U6-shRNA-CMV-GFP-NC质粒,通过脂质体分别转染到食管癌EC9706细胞中,并用G418抗生素进行抗性筛选、扩大培养,得到稳定转染细胞株eIF4E-shRNA细胞(eIF4E沉默)、eIF4E-OE细胞(eIF4E过表达)、eIF4E-OE-NC细胞(eIF4E过表达空载)、eIF4E-shRNA-NC细胞(eIF4E沉默空载)。3、通过Real Time PCR和Western Blot分别从mRNA水平和蛋白质水平对各组稳定转染细胞株进行鉴定：Real Time PCR检测各组细胞eIF4E mRNA表达水平,用双标准曲线法分析Ct(Cycle threshold)值,最后得出的数据用2-△△Ct法计算各组mRNA的相对表达水平。Western Blot检测各组细胞蛋白质的表达水平,实验结果通过Leica Application Suite4.0软件进行灰度值分析,通过计算;IF4E与GAPDH的灰度值比值得到各组细胞eIF4E蛋白的相对表达量。4、MTT法测定各组稳定转染细胞株的化疗药物敏感性：4种不同浓度的化疗药物顺铂(DDP)、氟尿嘧啶(FU)、紫杉醇(TAX),分别作用24h、48h后,用MTT法检测药物对eIF4E-shRNA细胞(eIF4E沉默)、eIF4E-OE细胞(eIF4E过表达)、eIF4E-OE-NC细胞(eIF4E过表达空载)、eIF4E-shRNA-NC细胞(eIF4E沉默空载)、EC9706细胞的生长抑制率。结果：1、质粒U6-shRNA-CMV-GFP-1、U6-shRNA-CMV-GFP-2、U6-shRNA-CMV-GFP-3、U6-shRNA-CMV-GFP-NC分别与PEGFP-N1质粒共转染至293T细胞后,荧光倒置显微镜下观察到各组细胞均发出绿色荧光。通过Leica Application Suite4.0软件分析Western Blot检测各组eIF4E和内参GAPDH的电泳条带,计算eIF4E与GAPDH的灰度值比值得到各组细胞eIF4E蛋白的相对表达量,分别为0.31、0.11、0.44、0.52。2、不同质粒转染EC9706细胞：不同质粒分别转染食管癌EC9706细胞后,荧光倒置显微镜下观察到eIF4E过表达细胞、eIF4E沉默细胞、eIF4E过表达空载细胞、eIF4E沉默空载细胞均发出绿色荧光。3、Real Time PCR检测eIF4E mRNA表达水平结果：得出的数据用2-△△Ct法计算EC9706细胞、eIF4E过表达EC9706细胞、eIF4E过表达空载EC9706细胞、eIF4E沉默EC9706细胞、eIF4E沉默空载EC9706细胞的mRNA的相对表达水平,分别为1.00、3.54、1.04、0.37、0.96。4、Western Blot检测eIF4E蛋白质表达水平结果：通过Leica Application Suite4.0软件分析EC9706细胞、eIF4E过表达EC9706细胞、eIF4E过表达空载EC9706细胞、eIF4E沉默EC9706细胞、eIF4E沉默空载EC9706细胞的eIF4E和内参GAPDH的电泳条带的灰度值,计算eIF4E与GAPDH的灰度值比值得到各组细胞eIF4E蛋白的相对表达量分别为0.97、1.54、1.01、0.45、1.04。5、MTT检测结果：1)在同一时间点(24h、48h),随着三种化疗药物浓度的逐渐增加,EC9706细胞、eIF4E过表达EC9706细胞、eIF4E过表达空载EC9706细胞、eIF4E沉默EC9706细胞、eIF4E沉默空载EC9706细胞的生长抑制率逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)；2)同一药物浓度作用于5种细胞48h与24h相比,生长抑制率均逐渐逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)；3)相同时间点、相同药物浓度,5种细胞对相同药物的生长抑制率不同,eIF4E过表达EC9706细胞与eIF4E过表达空载EC9706细胞、EC9706、eIF4E沉默EC9706细胞相比,生长抑制率均降低,差异有统计学意义(P<0.05)；eIF4E沉默EC9706细胞与eIF4E沉默空载EC9706细胞、eIF4E过表达EC9706细胞相比,生长抑制率均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：1、成功筛选出RNA干扰效果最强的U6-shRNA-CMV-GFP-2质粒。2、建立稳定转染不同质粒的细胞株：eIF4E过表达EC9706细胞、eIF4E过表达空载EC9706细胞、eIF4E沉默EC9706细胞及eIF4E沉默空载EC9706细胞。3、随着顺铂、氟尿嘧啶、紫杉醇的药物浓度的升高,eIF4E过表达EC9706细胞、eIF4E过表达空载EC9706细胞、eIF4E沉默EC9706细胞及eIF4E沉默空载EC9706细胞及EC9706细胞的生长抑制率随之升高；不同浓度的三种化疗药物作用于5种细胞48h的细胞生长抑制率高比24h的细胞生长抑制率高。4、eIF4E的过表达可以降低食管癌EC9706细胞对顺铂、氟尿嘧啶、紫杉醇的敏感性,用RNAi技术抑制eIF4E的表达,可以增加EC9706细胞对顺铂、氟尿嘧啶、紫杉醇的敏感性。