一、原代大鼠海马神经元培养、鉴定及形态学观察目的:通过对新生1 d内SD大鼠海马神经元培养,掌握大鼠海马神经元体外培养方法;利用免疫细胞化学鉴定,扫描电镜、H-E、Nissl染色法观察原代海马神经元形态学特点,测定细胞生长曲线。方法:新生1 d内SD乳鼠,体质量（7±1）g,断头取脑,于预冷D-hanks玻璃皿中,剥离两侧海马,体视显微镜下剥除血管、被膜,0.125%胰蛋白酶于37℃消化约20 min。含10% FBS的DMEM洗涤组织块3次,用抛光后的玻璃吸管反复吹打组织,悬起细胞悬液,以1～5×105密度接种于事先包被有多聚赖氨酸的玻璃片上,置于37℃,5% CO2培养箱内。1 d换为Neurobasal（含2% B27）培养基继续培养,于810 d可用于实验。取培养10 d神经元,固定,0.25%的Triton作用15 min,3%过氧化氢室温封闭内源性过氧化物酶,山羊血清封闭,倾去山羊血清加入小鼠抗大鼠微管相关蛋白-2（Microtubule Association Protein-2, MAP-2）、兔抗鼠神经元特异性烯醇化酶（Neuron Specific Enolase, NSE）一抗4℃过夜,生物素标记的羊抗兔或羊抗小鼠抗体,37℃,1 h,新鲜配制的过氧化酶标记亲合素,DAB染色,脱水透明,中性树胶封片。光镜下观察神经元MAP-2和NSE表达,计数阳性细胞百分率并进行显微摄影。细胞接种于96孔酶标板中,每2 d测定一次吸光度（AD）值并记录,共测定7次。苏木精伊红染色,脱水透明,中性树胶封片,观察。培养10 d的海马神经元,戊二醛固定,乙醇脱水,真空临界点干燥,镀金,日立-S3500扫描电镜观察并拍照。培养10 d的原代海马神经元,固定,1%甲苯胺蓝染色,脱水透明,中性树胶封片,镜下观察。结果:1原代培养的海马神经元细胞,6～8 h内开始贴壁,培养57 d神经元胞体丰满。随着培养时间延长,神经元胞体进一步增大,突起增粗增长,连接成网,细胞突起光晕明显,立体感强,以多极神经元为主,胞体呈三角形、梭形、椭圆形。培养3 w后,神经元开始退化,胞质中出现颗粒空泡,突起退化、出现核固缩、崩解。2原代培养海马神经元,用神经元特异性标记物MAP-2染色,细胞体和突起被染成棕褐色。NSE染色为胞浆染成棕褐色,突起部分着色。经鉴定神经元纯度达90%左右。3原代海马神经元生长曲线测定显示,海马神经元体外培养条件下经历了生长潜伏期（24 d）,对数生长期（48 d）,后进入生长平台期（814 d）,细胞生长处于停滞状态。原代培养海马神经元生长周期大约要810 d左右。4原代培养的海马神经元H-E染色,神经细胞胞核大而圆,核仁12个,胞核染色深,颜色呈蓝色,胞浆为红色。5海马神经元Nissl染色可见神经细胞胞体中尼氏颗粒,在神经元突起内很少能见到蓝染的尼氏体。6扫描电镜观察,培养的海马神经元以锥体形为主,其次为梭形、三角形。结论:1原代SD乳鼠海马神经元,培养10 d后细胞形态趋于成熟。相差显微镜下形态呈锥体形、梭形、三角形。2原代培养海马神经元免疫细胞化学染色为MAP-2、NSE阳性细胞,纯度达90%左右。3原代海马神经元培养经历一个生长潜伏期,指数生长期,平台期,生长周期大约为810 d。4海马神经元H-E染色为细胞核着色,呈深蓝色,胞浆为红色。5Nissl染色可见尼氏体位于细胞质内,神经突起内少见。6原代培养海马神经元电镜下可见胞体为锥体形、梭形、三角形等,另外可见突起较多。二、睾酮对H2O2暴露的原代培养海马神经元的神经保护作用目的:培养的SD乳鼠海马神经元,暴露于H2O2,观察自由基对海马神经元的损伤作用以及观察睾酮是否对自由基损伤的海马神经元具有神经保护作用和作用时间。方法:取原代培养10 d海马神经元,加入不同浓度H2O2,继续培养1 d后,观察细胞活力和MTT值,台朌蓝染色计数活细胞,计算细胞活力百分数。细胞活力（%）=细胞总数-蓝染细胞（死细胞）/细胞总数。细胞分为对照组、H2O2处理组、单独给予睾酮组和先给予睾酮后接受H2O2处理组。对照组仍为原培养基,H2O2组以不同浓度H2O2与神经元培养基共同培养,1 d后进行测定细胞活力与MTT值。睾酮组细胞在测定前1 d加入浓度为10 nM睾酮,再与培养基混合培养1 d后进行测定。睾酮加H2O2组细胞同样在加入H2O2前1 d先给予10 nM睾酮与培养基混合培养1 d,后再加入不同浓度H2O2,共同培养1 d后进行测定。为了观察雄激素发挥作用的时间,培养10 d的细胞随机分为4组:第一组在暴露于H2O2前1 d给予睾酮组,加入H2O2后睾酮仍持续1 d（T pre T post group）;一组在给予H2O2前1 d加入,给予H2O2同时去除睾酮组（T pre 0 post group）;另一组给予H2O2同时给予睾酮组,共同培养1 d后进行测定（0 pre T post group）;最后一组为给予H2O2后8 h再给予睾酮,共同培养1 d后进行测定（0 pre T post 8h）,分别测定4组细胞活力。原代培养海马神经元按一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthesis, NOS）、超氧化物岐化酶（Superoxide Dismutase, SOD）及丙二醛（Malondialdehyde, MDA）说明书测定,蒸馏水调零,测各管吸光度值。结果:1加入不同浓度H2O2后,对海马神经元影响不同,暴露于10μM H2O2对培养的海马神经元生存率影响不明显,但20200μM H2O2可引起神经细胞不同程度损伤（P<0.05）,各组细胞活力随H2O2浓度升高呈现下降的趋势,以H2O2浓度为100μM时候对神经元活力影响较为明显。MTT值减少也以100μM H2O2作用最为明显,呈现与细胞活力相似的结果。2无睾酮预处理组加入H2O2（100μM）后可见神经元数目减少,突起变细萎缩,胞体变小,细胞培养液内可见较多细胞碎片,细胞内空泡增多,暴露于H2O2前用睾酮进行预处理细胞生长较好,突起数目略有减少,但与无睾酮组相比有明显不同。睾酮能明显提高暴露于H2O2损伤的细胞活力和MTT值（P<0.05）。3不同时间加入睾酮对H2O2损伤海马神经元神经保护作用不同,细胞活力在提前给予睾酮且加入H2O2后持续存在组（T pre T post group）和暴露于H2O2同时给予睾酮组比较高（0 pre T post group）,与其它各组相比差异明显（P<0.05）,其它组中细胞活力数值较低。4分别测定给予不同浓度H2O2后培养液中NOS、SOD及MDA含量,与对照组相比,单独给予睾酮组上述三项指标差异不明显（P>0.05）。提前不给予睾酮,仅暴露于H2O2组,NOS、MDA值升高,同时SOD值降低,与对照组相比,有明显的统计学意义（P<0.05）。在暴露于H2O2前给予睾酮处理,与不给睾酮处理直接暴露于H2O2组相比,有明显的统计学差异（P<0.05）。结论:1H2O2对原代培养海马神经元有损伤作用,其中以100μM H2O2对细胞影响最大,细胞活力明显下降。2加入10 nM睾酮对暴露于自由基损伤的海马神经元有明显神经保护作用,与无睾酮组相比,差异显著。3睾酮可以在短时间（1 d）内发挥对暴露于H2O2的海马神经元保护作用。4原代培养海马神经元在暴露于H2O2后SOD值下降,NOS和MDA升高,提前1 d给予睾酮可以有效保护H2O2对海马神经元的神经损伤作用。三、睾酮对原代海马神经元神经保护作用中细胞调亡的研究目的:用荧光染色和Western blot方法观察睾酮发挥神经保护作用中是否有抗神经元凋亡机制的参与。方法:大鼠原代培养10 d海马神经元,分为对照组、H2O2处理组、及预先加入睾酮后再暴露于H2O2组,固定,Hoechst 33258室温染色,清洗,封片剂封片,荧光显微镜下观察并拍照。原代培养海马神经元Bcl-2和Bax蛋白进行Western blot分析。首先按实验分组设计分别加入H2O2及睾酮,收集细胞。将细胞溶于200μL裂解液,加入Aprotinin、LEUPTIN、PMSF、DTT,裂解60 min,超声裂解仪冰浴,反复吹打。4℃低温离心机离心取上清,分装,考马斯亮兰蛋白定量。制备分离胶及浓缩胶,待浓缩胶完全聚和,取下梳子,将凝胶板按正负极方向置于电泳槽中,注入电泳缓冲液,液面高于上样槽。整理上样孔,轻轻吹打加样孔。取待测蛋白150μg,加入上样缓冲液混合,离心混均,煮沸8 min蛋白变性,上样及低分子量蛋白Marker,电泳。待样品到达浓缩胶与分离胶交界处时,调整恒压为120V。当指示剂迁移至距胶底约1 cm处时关闭电源,停止电泳。漂洗后按3层滤纸、NC膜、凝胶、3层滤纸顺序依次叠放,转膜。5%脱脂奶粉封闭,加入一抗,兔抗大鼠Bcl-2、Bax（对照组用1% PBS代替）, 4℃静置过夜。TBS漂洗,滴加辣根过氧化物酶标记二抗, TBS漂洗,免疫显影,暗盒中曝光,曝光时间根据条带亮度而定,取出X光片显影定影。使用Hema成像分析系统对显色条带进行半定量分析,用任意单位AU（DareaⅹDdensity）表示蛋白条带的面积×灰度值。GAPDH表达做为内参,目的蛋白与GAPDH的AU比值ratio值代表各组蛋白相对表达水平。结果:1原代培养海马神经元暴露于H2O2,经Hoechst33258显色后神经元呈均匀蓝色光,染色后细胞核明显。在H2O2组（100μM）可见凋亡的细胞,胞核呈深染半月形或碎块状荧光,突起不明显。预先加入睾酮组再暴露于H2O2,海马神经元可见细胞核染色明显,胞核清楚,无明显核碎片。2Western blot显示对照组海马神经元有极少量Bcl-2与Bax表达,加入H2O2后细胞Bax表达增加,而Bcl-2表达下降,与对照组相比,差异明显（P<0.01）。提前加入睾酮,后暴露于100μM H2O2,可见Bcl-2表达增加,Bax表达下降,与H2O2组比较,有明显统计学差异（P<0.05）。结论:1自由基对原代培养海马神经元的损伤机制中,有细胞凋亡机制参与,预先给予睾酮后能对细胞起到神经保护作用。2正常海马神经元内只有少量Bcl-2与Bax表达,自由基损伤后的海马神经元细胞表达Bax增加,凋亡抑制基因Bcl-2表达减少。预先给予睾酮组神经元内Bcl-2表达明显增加,而Bax表达则显著减少。四、睾酮对自由基损伤的海马神经元神经保护作用中细胞内Ca2+含量变化目的:观察睾酮对H2O2损伤的神经元神经保护作用中是否有细胞内Ca2+浓度变化。方法:培养10 d海马神经元,分为对照组、H2O2组、预先加入睾酮后再加入H2O2组。对照组给予原细胞培养基,H2O2组依次加入浓度为10、20、40、60、80、100、200μM H2O2,然后测定加入H2O2前后细胞内Ca2+浓度。睾酮组于实验前1 d预先加入浓度为10 nM的睾酮,1 d后加入100μM H2O2对细胞进行测定。将Fluo-3, AM工作液加入培养10 d原代海马神经元中,负载60 min,将睾酮组神经元也用相同方法进行钙探针标记。HEPES洗涤,共聚焦显微镜下观察。将负载好的细胞置于无菌培养皿中,以不同浓H2O2与Nerobasal（含2% B27）混合,激发波长为488 nm,发射波长为528 nm检测荧光值（FI）。各组都取加入H2O2前与加入后细胞内Ca2+荧光强度,每分钟扫描30帧图像,连续扫描15 min,观察细胞内Ca2+荧光强度变化。测定后用激光共聚焦专用软件进行分析,测定每组给药前后F0和Fi值,然后以二者比值（ratio）反应细胞Ca2+浓度变化。结果:1对照组无明显细胞内Ca2+浓度变化。在H2O2组,与对照组相比,FI值变化有明显的统计差异（P<0.05）。2在H2O2组,海马神经元细胞内Ca2+浓度在一定范围内有变化。与对照组相比,60μM以下时,细胞内Ca2+荧光值变化不明显（P<0.05）。80μM以上H2O2引起细胞内Ca2+开始明显升高,与加入H2O2前荧光值相比,差异显著（P<0.05）。3预先加入睾酮后再暴露于H2O2组细胞内Ca2+浓度变化与对照组相比,无显著性差异（P>0.05）。与各相同浓度、单纯加入H2O2组相比,细胞内Ca2+荧光比值明显减低（P<0.01）。结论:1原代培养的海马神经元,加入不同浓度H2O2后,细胞内可见Ca2+含量明显升高,以100μM和200μM引起的细胞内Ca2+增加最为明显。2睾酮能够明显降低自由基损伤引起的原代培养的海马神经元内Ca2+含量变化。