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宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一,也是全球女性癌症致死的主要原因之一。在早婚、生育、人乳头瘤病毒（HPV）感染等因素作用下,宫颈癌的患病率往往较高,由于该病发展迅速,大多数女性在首次诊断时已为中晚期。临床上宫颈癌有多种治疗方法,放疗为主要治疗方法之一,但由于辐射抗性的存在,使患者对于放疗作用敏感性下降,严重影响了放疗患者的预后。但相关机制研究目前并未明确,因此,为增加诊断效率,提高放射治疗效果,探究宫颈癌辐射敏感性相关机制尤为重要。解偶联蛋白（uncoupling protein 2,UCP2）是一种位于线粒体内膜上的阴离子载体蛋白,介导线粒体内膜的质子渗漏过程,从而影响细胞内活性氧的生成,进而调节细胞的氧化应激过程,进一步通过改变线粒体自噬,细胞增殖,细胞侵袭以及细胞凋亡,肿瘤进展以及化疗耐药等来影响肿瘤患者的预后。本研究以Hela和Caski细胞为主要研究对象,以UCP2为目标基因,探究UCP2在辐射敏感性中的作用及线粒体相关机制。目的:以UCP2调节细胞氧化应激为切入点,探讨UCP2在宫颈癌细胞辐射敏感性中的作用机制,为优化宫颈癌个体治疗方案,使之成为宫颈癌诊断及治疗的新靶点提供理论依据。方法:1.利用Q-PCR法和Western Blot法检测不同种宫颈癌细胞中的本底表达水平,选择后续实验所用细胞,检测Hela细胞在经过辐照后不同时间点的UCP2表达变化;2.使用Hela和Caski细胞,通过瞬时转染的方法分别构建UCP2沉默和过表达模型,利用Q-PCR法和Western Blot法分别检测转染效率;3.采用集落形成和CCK-8实验对经过处理的细胞的克隆形成和增殖存活能力进行检测;4.利用DCFH-DA探针检测UCP2对辐射诱导的宫颈癌细胞的ROS的影响进行检测;5.利用Mitotracker GreenFM检测UCP2对两种宫颈癌细胞经过辐照后6 h,12h,24 h的线粒体膜完整性的变化进行检测;6.利用罗丹明123（Rhodamine123）对两种宫颈癌细胞经过辐照后6 h,12 h,24 h的线粒体膜电位变化进行检测;7.利用流式细胞术分别对UCP2沉默和过表达模型联合X线照射的细胞凋亡与周期进行检测;8.利用免疫荧光法对Hela DNA损伤相关蛋白γ-H2AX的表达变化进行检测;9.使用Western Blot法对于细胞凋亡、周期、DNA损伤修复相关蛋白水平变化进行检测,探究UCP2在宫颈癌细胞凋亡、周期以及DNA损伤方面的相关分子机制;10.实验数据以平均值±标准差（x±s）表示,利用SPSS 24.0进行统计学分析,利用软件GraphPad Prism 6.0绘制柱状图,利用方差分析进行统计学分析,P<0.05被认为具有统计学差异。结果:1.UCP2在不同宫颈癌细胞中的本底表达水平不同,而且辐照可以诱导UCP2表达在所测的五种宫颈癌细胞中,UCP2在Hela细胞中本底表达较高,采用Hela细胞作为UCP2沉默模型所用细胞;UCP2在Caski细胞中本底表达水平相对低,采用Caski细胞作为UCP2过表达模型所用细胞。并且Hela细胞在辐照后6 h,12 h,24 h,UCP2蛋白水平随时间延长而增加。2.UCP2对宫颈癌细胞增殖存活能力的影响UCP2沉默后Hela细胞在经过2、4、6、8、10 Gy辐照后,集落形成能力相较于阴性对照组有较大程度的降低;并且在经过4 Gy辐照后,UCP2沉默后的Hela细胞的增殖存活能力明显降低,但在经过8 Gy辐照后的UCP2过表达的Caski细胞的增殖存活能力相较于阴性对照组的变化并不明显,考虑与转染效率有关。3.UCP2对辐照诱导的宫颈癌细胞中ROS的影响在两种宫颈癌细胞中,辐照组相较于未辐照组细胞中的ROS生成量均有升高,以Hela细胞中对比更为明显。沉默UCP2的Hela细胞辐照后6 h,12 h时间点的ROS生成量相较于阴性对照组有较大程度的增加（P<0.05）,在辐照后24h,各组ROS生成量相差不大,考虑与ROS消散有关;而在辐照后6 h、12 h,UCP2过表达组的Caski细胞相较于阴性对照组有一定程度的降低,虽然差距不如Hela细胞显著,但具有统计学差异。4.UCP2对辐射诱导的宫颈癌细胞的线粒体结构与功能的影响Hela细胞在经过UCP2沉默后,在辐照后6 h,12 h后,能够较为明显的升高线粒体膜电位,促进ROS生成,并且在过量ROS作用下会促使线粒体膜电位崩溃,即辐照后24 h,UCP2沉默组Hela细胞膜电位明显降低;而辐照后的UCP2过表达的Caski细胞中膜电位变化一直处于高于阴性对照组的状态。在线粒体膜电位与ROS的变化的影响下,细胞内线粒体膜完整性也发生了改变。我们观测到,辐照对于UCP2沉默后的Hela细胞线粒体膜完整性相较于对照组呈现进一步破坏,并且辐照对于过表达UCP2的Caski细胞中线粒体膜的破坏性相对减弱。5.UCP2对辐射诱导的宫颈癌细胞凋亡的影响未辐照组的宫颈癌细胞的凋亡率没有明显区别,但经过辐照后,细胞的凋亡率明显增加,其中UCP2沉默增强了辐射诱导的Hela细胞的凋亡（P<0.05）,并且与线粒体诱导的凋亡通路中抑凋亡蛋白Bcl-2,Bcl-xl水平在UCP2沉默组呈现较阴性对照组降低的现象,促凋亡蛋白Cleaved-Caspase3,Cleaved-Caspase9以及与凋亡小体形成相关蛋白Cyt-c,Apaf-1水平在UCP2沉默组表现出进一步增加的现象;而在Caski细胞中只观察到了Bcl-xl,Caspase-9和Cyt-c的表达水平出现了预期的变化,考虑到与UCP2过表达质粒的瞬时转染效率较低有关。6.UCP2对辐射诱导的宫颈癌细胞周期的影响我们通过流式细胞术对两种细胞的细胞周期变化进行了检测,未辐照组中细胞周期变化无明显差别,但Hela和Caski细胞分别在经过4 Gy、8 Gy辐照后,会出现较为明显的G2/M期阻滞,并且在辐照后的Hela细胞中,与阴性对照组相比,沉默UCP2后增强了这种阻滞效应（P<0.05）;在辐照后的Caski细胞中,UCP2过表达在一定程度上降低了辐照所引起的周期阻滞效应。Western Blot结果也显示,与细胞周期相关蛋白-G2期细胞周期检查点相关蛋白CyclinB、CDC2也表现出了相应变化。7.UCP2对辐射诱导的宫颈癌细胞DNA损伤的影响我们使用免疫荧光法对辐照后不同时间点的Hela细胞内γ-H2AX的焦点形成数进行了检测,发现在辐照后6 h和12 h时间点,UCP2沉默组与未辐照组相比,γ-H2AX焦点形成明显增加,但辐照组内部各组之间差别不大,但在辐照后24 h,UCP2沉默组的γ-H2AX焦点形成相较于阴性对照组明显增加,即UCP2增强了X射线对于Hela细胞的DNA双链断裂损伤;并且Western Blot结果也显示,与DNA损伤修复相关蛋白Ku70,Rad51在辐照后UCP2沉默组表达水平相较于阴性对照组有一定程度的降低;并且通过Western Blot也检测到,在辐照后12 h,Caski细胞中的γ-H2AX蛋白水平在UCP2过表达组相较于阴性对照组减少,UCP2过表达减弱了电离辐射对于细胞的DNA损伤,而Ku70蛋白水平在UCP2过表达组也表现出增加。结论:1.电离辐射可以诱导宫颈癌细胞中UCP2的表达;2.UCP2可以影响电离辐射诱导宫颈癌细胞内ROS的产生,即沉默UCP2会促进辐射诱导的Hela细胞的ROS生成,UCP2过表达则会一定程度减弱辐射诱导的Caski细胞的ROS生成能力;3.UCP2可以引起辐射诱导的宫颈癌细胞内线粒体部分结构与功能的变化,以线粒体膜电位和膜完整性为主,进一步影响线粒体诱导的凋亡通路的激活;4.UCP2可以引起电离辐射诱导的宫颈癌细胞细胞周期发生改变,以G2期阻滞最为显著,即UCP2沉默可以促进辐射诱导的宫颈癌细胞G阻滞,UCP2过表达则会相应减弱阻滞作用;5.以上凋亡通路的激活的机制大部分可以归结于UCP2对宫颈癌细胞内ROS的生成变化,并且生成的ROS产生间接影响了辐射诱导的宫颈癌细胞的DNA损伤及修复。总之,UCP2在宫颈癌细胞的辐射敏感性中起着非常重要的作用,有望成为宫颈癌放射治疗的新靶点