PTEN是第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因,是一种广泛的多肿瘤抑制基因,其适度的表达可阻止细胞生长、促进细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞浸润、转移和肿瘤血管生成。多数学者认同PTEN是一个可与p53、pRb相提并论的重要功能分子,成为又一个抑癌明星基因。PTEN可能通过多种机制导致其功能性失活,包括遗传(如基因的突变、缺失)和表遗传方面(如DNA启动子区的甲基化、染色质组蛋白的化学修饰)的影响,以及转录、翻译后的调控等。在HCC组织中PTEN的表达缺失可以导致肝细胞发生恶变,失去了对细胞生长的负调控,导致肿瘤进行性生长。尽管有文献报道PTEN蛋白在HCC中表达率较低,但其低表达的机制不甚明了。为了探讨抑癌基因PTEN在HCC中的表达失活的原因,我们首先对56例原发性肝癌标本进行了PTEN免疫组化研究,结果显示PTEN蛋白在肝癌组织中的阳性表达率明显低于癌旁肝组织(P<0.01),且其表达程度与HCC的病理分级明显相关;同时,在肿瘤TNM分期中,Ⅱ期的PTEN阳性率显著高于Ⅲ、Ⅳ期,而发生肝内转移的肝癌组织PTEN阳性率低于未转移的肝癌组织。提示PTEN可能在肿瘤的发生、发展及转移进程中起重要作用。为了寻找PTEN在HCC组织中低表达的原因,本研究采用了PCR-SSCP技术结合DNA测序,寻找PTEN编码区基因的突变;结合PTEN在其它肿瘤突变的特点,选择了PTEN突变的热点区-第5、8号外显子进行检测。尽管PCR-SSCP检测和测序证实5例标本发生了PTEN基因突变,但突变均位于内含子4区域,而在5号外显子和8号外显子编码区域没有检测到PTEN突变的发生,且在这5例突变的标本中,三例PTEN免疫组化呈阴性表达,两例呈阳性表达。因此,在HCC组织中基因突变可能不是PTEN失活的主要原因。我们采用甲基化特异的PCR法(MSP)进一步从目前对PTEN缺失机制研究较热的DNA启动子甲基化角度寻找原因,结果在56例HCC组织中,9例标本发生PTEN启动子区的甲基化(16.1%),且这9例标本PTEN免疫组化均呈阴性表达。统计学分析表明:启动子区的高甲基化在HCC组织病理分级中有显著差别。这一结果表明,PTEN启动子甲基化可能是HCC组织中PTEN低表达的原因之一,基因启动子甲基化在PTEN失活导致的HCC的发生、发展中可能起重要作用。丙型肝炎病毒(HCV)是与肝细胞肝癌发生密切相关的致病因子。HCV通过其表达的蛋白质参与癌变。其中以核心蛋白、NS3和NS5蛋白与细胞的恶性转化关系最为密切。HCV核心蛋白具有致癌潜能,目前认为,核心蛋白可能通过作用于宿主细胞内信号蛋白,激发信号转导级联而发挥致癌效应。尽管对PTEN作用机制目前研究较多,但对PTEN表达的调控所知甚少,直到近两年来,对PTEN基因和蛋白的调控研究才有所进展。而在肝癌组织中研究PTEN表达的调控更为罕见。为此,在本实验中,我们选择了HCC的重要致癌因素-HCV的核心蛋白为研究对象,探讨核心蛋白在可能的致癌途径中对抑癌基因PTEN发挥了什么样的作用。本研究选择肝癌细胞系HepG2为实验对象,稳定转染了HCV核心蛋白,并观察到转染核心蛋白组细胞的生长较HepG2细胞组和转染空质粒组细胞生长快,克隆形成率也较后两组高;而经流式细胞仪检测三组细胞的细胞周期,发现转染核心蛋白组S期的细胞比例略高于空质粒组和HepG2细胞组。这一结果验证了HCV核心蛋白能够引起细胞增殖、促进细胞生长。同时,还发现HCV核心蛋白促进细胞生长的作用与其对抑癌基因PTEN的抑制作用有关。本研究又从基因mRNA和蛋白水平两方面进行了验证。采用Real-time RT-PCR的方法对PTEN基因mRNA的水平进行实时半定量的检测,发现其与HepG2细胞和转染空质粒组相比,转染核心蛋白组PTEN基因mRNA的水平明显下调。转染不同浓度的核心蛋白编码基因,发现转染组细胞随着转染核心蛋白编码基因浓度的增大,PTEN mRNA的水平逐渐降低。表明,HCV核心蛋白可以下调抑癌基因PTEN mRNA的水平,且这种抑制作用随着核心蛋白浓度的增大而增强。在蛋白质水平,通过对PTEN蛋白和其下游分子AKT、p-AKT进行Western blot检测,结果显示:转染核心蛋白组PTEN蛋白的表达水平低,而p-AKT的表达水平高,提示HCV核心蛋白抑制了PTEN基因蛋白的表达,进而解除了PTEN抑制其下游作用分子AKT磷酸化的作用,使PTEN对PI3K/AKT通路的负调控作用减弱,不能完全行使其抑制细胞生长、促进细胞凋亡的作用。这也进一步揭示了HCV核心蛋白能够促进细胞生长、抑制宿主细胞凋亡、促进肝细胞肿瘤发生的原因。进一步研究发现,转染HCV核心蛋白的HepG2细胞NF-κB被活化,而在NF-κB的抑制剂PDTC作用下,NF-κB的活性降低,失去了对PTEN表达的抑制作用,使PTEN部分恢复负调控AKT磷酸化的功能。双荧光素酶检测后发现,,被激活的NF-κB可通过作用于PTEN启动子区来调节PTEN的表达,使PTEN表达下降。综上所述,本实验结果显示,PTEN蛋白在肝癌组织中的阳性表达率低于癌旁肝组织,提示PTEN可能在肿瘤的发生、发展及转移进程中起重要作用。经基因突变和甲基化检测结果发现在HCC组织中基因突变可能不是PTEN失活的主要原因,而PTEN启动子甲基化可能是在HCC组织中PTEN低表达的原因之一,而基因启动子甲基化导致PTEN失活,可能在HCC的发生、发展中起一定作用。在肝癌HepG2细胞系中转染HCV核心蛋白,细胞生长速度加快,增殖能力提高,同时抑癌基因PTEN mRNA和蛋白的表达水平均受到抑制作用,进而解除了PTEN抑制其下游作用分子AKT磷酸化的作用;进一步研究发现,HCV核心蛋白可能通过激活NF-κB分子,使活化的NF-κB作用于PTEN启动子区来调节降低PTEN的表达。这些研究结果可能均有助于解释肝癌发生、发展的原因。