论文部分内容阅读
植物病毒病在世界范围内广泛存在,它是仅次于真菌病害的一大病害,严重危害重要的经济作物。随着基因工程的迅速发展,使得利用抗病育种这一技术防治植物病毒病得到更为广泛的应用。近年的研究表明,将核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating proteins,RIPs)基因转化植物,转基因植物获得抗病毒能力。因此,本文克隆获得四种核糖体失活蛋白(无毒缺失突变体PAP-c、α-MC、MAP30、Luffin-a),将四种RIPs在本氏烟中异源表达,在烟草中观察四个蛋白在细胞中的定位情况。研究RIPs对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的抑制作用及其引起的抗性防御反应。为解释不同RIPs对植物病毒的抗性作用及对RIPs诱导植物产生抗性抵御病毒侵染的作用提供依据。根据GenBank中已报道的商陆抗病毒蛋白基因、丝瓜核糖体失活蛋白基因和苦瓜素基因全序列,设计并合成扩增PAP-c和α-MC、MAP30、Luffin-a基因全长引物,通过RT-PCR及基因克隆方法,从苦瓜、丝瓜和商陆春叶克隆得到苦瓜α-MC、MAP30、丝瓜Luffin-a和商陆PAP-c;用Wolf PSORT预测蛋白定位,将苦瓜α-MC、MAP30、丝瓜Luffin a和商陆PAP-c融合在GFP的N端,构建融合绿色荧光蛋白的瞬时表达载体,亚细胞定位根据融合标记的GFP来确定,从而验证预测结果;在本氏烟中植物中通过根癌农杆菌介导的方法瞬时表达RIPs,再接种TMV,病毒在接种叶片的蛋白表达量和RNA积累量通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光定量RT-PCR两种方法检测,分析瞬时表达RIPs的抗病毒效果。利用实时荧光定量RT-PCR检测植物防卫相关基因NPR1、PR1、PR2的表达,探究RIPs的抗病毒机理。克隆得到基因α-MC、MAP30、Luffin-a和PAP-c,分别为861、861、831和711 bp。Wolf PSORT预测显示RIPs主要定位于细胞质膜上。用共聚焦荧光显微镜下观察发现,标记GFP的RIPs均定位在本氏烟叶片表皮细胞质膜上,与Wolf PSORT预测的RIPs定位结果相一致。异源表达四种RIPs的植物细胞无明显毒性,表达部位细胞完整。在本氏烟中异源表达RIPs后,再接种TMV-GFP,在紫外灯下观察发现四种RIPs处理后的本氏烟在接种TMV-GFP 48 h后没有出现绿色荧光,而对照组出现荧光。72 h后处理组出现零星荧光,但对照组的绿色荧光开始扩散,连续观察,处理组几乎没有变化,接种TMV-GFP 6天后,发现处理组的绿色荧光几乎没有扩大的趋势,而对照组的绿色荧光已扩散至心叶;ELISA检测表明,在接种TMV-GFP 6天后的叶片中,对照组与健康植物的OD492比值几乎已达到处理组的10倍以上;实时荧光定量PCR检测TMV RNA的含量,结果显示对照组TMV RNA表达量是处理组的149倍,表明四个RIPs对TMV复制和移动都有明显抑制;实时荧光定量PCR结果分析显示,NPR1基因在只注射TMV、单独分别表达α-MC、MAP30、Luffin-a以及分别表达α-MC、MAP30、Luffin-a后注射TMV的本氏烟中都被诱导表达,但后者的表达量是前两个处理的约1.5-3倍左右,在只分别接种α-MC、MAP30、Luffin-a和分别表达α-MC、MAP30、Luffin-a后注射TMV的本氏烟中都检测到PR1、PR2,但后者的表达量显著高出前者约5-7倍,表明异源表达RIPs对植物病毒的抗性作用可诱导植物中防卫相关基因NPR1、PR1、PR2的表达,从而引起更强的防御反应。异源表达RIPs显著抑制TMV,能够激活植物防卫反应,且对植物细胞无明显毒性。研究结果为利用异源表达RIPs方法开发控制植物病毒新产品提供了参考依据。