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木聚糖酶在医药保健、纸浆漂白、动物饲料等方面表现出广泛的应用前景。但是目前商业化的木聚糖酶大多在中温环境中活性较高，而一些行业需要在高温环境中活性较高的木聚糖酶，因而木聚糖酶在这些行业的应用受到了很大的限制。本实验室业已克隆一个11家族木聚糖酶的成熟肽基因序列Aoxyn11A，并通过氨基端氨基酸替换构建杂合酶基因AEx11A，将该两个基因分别在毕赤酵母GS115中表达并比较表达酶的热稳定性，结果表明杂合酶AEx11A的热稳定性优于野生型酶AoXyn11A。该杂合酶涉及多个氨基酸的替换，单个因素的影响在提高酶热稳定性中的作用并不清楚。本实验拟在其基础上，通过定点突变分别引入氢键、二硫键、芳香族氨基酸等作用位点并分析比较突变酶的热稳定性，深入探讨木聚糖酶的耐热机理。应用DNAMAN6.0软件对嗜热酶EvXyn11TS和AoXyn11A序列比对，结果显示两种酶氨基端37个氨基酸(以AoXyn11A计)序列相似性为40.5%，而其后的氨基酸序列的相似性超过70%。由于EvXyn11TS的热稳定性高于AoXyn11A，暗示着这两个酶的氨基端序列可能和其热稳定性关系密切。以AoXyn11A为母本，在EvXyn11TS相应的位置上引入氨基酸依次为天冬酰氨(N)、丙氨酸(A)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)和T32C突变，分别构建突变酶Aoxyn11AC5和Aoxyn11AC5-C32。同源建模显示氨基酸序列NAQTC在两个突变酶里引入了氢键，而突变T32C则在突变酶Aoxyn11AC5-C32引入了二硫键；分子模拟显示两个突变酶有着比野生型酶低的原子均方根偏差(RMSD)值，这预示着突变酶比野生型酶在高温环境中更为稳定。将这三个基因分别由毕赤酵母GS115表达并分析温度对三种表达酶的影响，在55℃水浴30min后，AoXyn11AC5–C32保留49%的起始活性，AoXyn11AC5和AoXyn11A分别为12%和3%，表明两个突变酶的热稳定性优于野生型酶，进一步的讨论表明随着突变酶β折叠股A1和A2之间相互作用力的增强，其热稳定性也相应增强。根据该理论，突变N9H(组氨酸)被引入野生型酶，同源建模显示引入组氨酸可以在酶β折叠股B1、B2和A2间形成芳香环相互作用和氢键作用，有利于其相互作用力的增强。将AoXyn11A、AoXyn11AN9H分别由毕赤酵母GS115表达并分析温度对表达酶的影响，在50℃水浴30min后，AoXyn11AN9H保留82%的起始催化活性，而AoXyn11A则为52%，表明突变酶AoXyn11AN9H的热稳定性优于野生型酶。结论：木聚糖酶AoXyn11A的氨基端与酶的热稳定性关系密切，无论是氢键、二硫键或芳香族氨基酸，都可以通过使木聚糖酶氨基端β折叠股之间的相互作用更为紧密，从而提高酶的热稳定性。