过氧化氢、维甲酸对A549细胞p-p38、MKP-1和HDAC-1、-2、-3表达的影响

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第一部分:不同浓度过氧化氢对A549细胞p-p38、MKP-1和HDAC-1、-2、-3的影响目的通过建立不同浓度过氧化氢(H2O2)干预的A549细胞模型,探讨不同浓度H2O2对A549细胞p-p38、MKP-1和HDAC-1、-2、-3蛋白表达的影响。方法不同浓度H2O2干预A549细胞12h,采用MTT、CCK8和LDH法检测A549细胞活力和受抑情况,Western blot法检测p-p38、MKP-1和HDAC-1、-2、-3蛋白表达。结果1.随着H2O2浓度提高和作用时间延长,A549细胞存活率呈浓度、时间依赖方式下降。结合CCK8、MTT和LDH结果,选择H2O2干预12h作为后续研究干预时间,这样既可对A549细胞产生较明显影响,同时又不会对细胞造成太大伤害影响后续实验结果。2.不同浓度H2O2干预A549细胞12h,与对照组(H2O2浓度为0umol/L)相比,随着H2O2浓度增加,p-p38、MKP-1蛋白表达水平呈逐渐升高趋势,当H2O2浓度增高至400umol/L时,p-p38、MKP-1蛋白表达量与对照组差异显著(p<0.01);随着H2O2浓度的增加,HDAC-1、-2、-3蛋白表达水平呈逐渐降低趋势,HDAC-1、-2、-3对H2O2浓度敏感性不同,当H2O2浓度增加至100umol/L时,HDAC-1表达与对照组差异具有统计学意义(p<0.05),增加至200umol/L时,HDAC-3表达与对照组差异具有统计学意义(p<0.05),增加至400umol/L时,HDAC-2表达量与对照组差异具有统计学意义(p<0.05)。结论通过建立氧化应激性肺损伤A549细胞模型,初步证实p-p38、MKP-1和HDAC-1、-2、-3参与肺细胞氧化应激性损伤过程。第二部分:过氧化氢、维甲酸对A549细胞p-p38、MKP-1和HDAC-1、-2、-3表达的影响目的建立H2O2和维甲酸(RA)干预的A549细胞模型,探讨H2O2和RA对A549细胞p-p38、MKP-1和HDAC-1、-2、-3蛋白表达的影响。方法取对数生长期A549细胞随机分为4组(对照组、H2O2组、RA组、H2O2+RA组)干预8、12、24h,采用Western blot法检测p-p38、MKP-1和HDAC-1、-2、-3蛋白表达,流式细胞仪检测A549细胞早期凋亡、晚期凋亡和坏死情况。结果1.RA和H2O2干预A549细胞8、12、24h,干预时间为8h时,与对照组比较,H2O2组p-p38蛋白表达水平显著增高(p<0.05),RA可使H2O2干预后的A549细胞p-p38蛋白表达部分降低,但与H2O2组相比差异不显著(p>0.05);RA组和H2O2组MKP-1蛋白表达水平均显著升高(p<0.01),两者同时使用时MKP-1表达进一步增高,与H2O2组相比差异具有统计学意义(p<0.01);H2O2组HDAC-1、-2、-3表达水平不同程度降低(p<0.05),RA可使H2O2干预后的A549细胞蛋白HDAC-1、-2表达增高,与H2O2组相比差异具有统计学意义(p<0.05),但对HDAC-3蛋白促表达作用未见明显统计学差异(p>0.05)。干预时间为12、24h时,与对照组相比,H2O2组p-p38蛋白表达水平显著增高(p<0.01),RA可使H2O2干预后的A549细胞p-p38蛋白表达显著降低(p<0.05);MKP-1蛋白表达趋势基本与8h一致;H2O2组HDAC-1、-2、-3表达水平不同程度降低(p<0.01),RA可使H2O2干预后的A549细胞蛋白HDAC-1、-2、-3表达部分增高,与H2O2组相比差异具有统计学意义(p<0.05)。2.RA和H2O2干预A549细胞8、12、24h,干预时间为8h时,与对照组比较,H2O2可使早期凋亡细胞明显增加(p<0.01),晚期凋亡+死亡细胞增加不显著(p>0.05),RA对H2O2诱导凋亡的细胞未见明显保护作用(p>0.05);干预时间延长至12、24h时,H2O2使早期凋亡细胞和晚期凋亡+坏死细胞均明显增加(p<0.001),RA可部分逆转H2O2干预所导致的细胞凋亡、坏死,与H2O2组相比差异具有统计学意义(p<0.001)。结论初步证实RA可通过调控HDACs和MKP-1表达,调节p38 MAPKs信号通路活性,在肺细胞氧化应激性损伤中发挥保护作用。
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