本论文以原代培养肉鸡鸡胚心肌细胞为模型进行了五个体外试验,研究锰对鸡胚心肌细胞的抗热应激效应及其分子机制,为缓解热应激对肉鸡等家禽的负面影响提供系统、深入的科学理论依据。试验一:构建原代鸡胚心肌细胞模型并测定心肌细胞持续活力。运用细胞培养技术、通过显微镜观察细胞形态以及经免疫组化鉴定心肌细胞,成功构建了原代鸡胚心肌细胞模型。通过测定细胞培养液中的酶活力,间接评价鸡胚心肌细胞活力,为后续试验提供活力较好且稳定的细胞模型奠定基础。模型构建方面,鸡胚心肌组织用0.12%胶原酶II 37℃消化8 min,800 r/min离心5 min分离细胞,收集细胞并用培养液重悬,经2次差速贴壁纯化后的心肌细胞接种在6孔培养板上,并在40℃、95%空气和5%CO2条件下培养。培养的原代鸡胚心肌细胞生长快速、活跃,培养24 h后可观察到心肌细胞有明显的自律性搏动,72 h后达到95%的汇合,可作为研究鸡胚心肌细胞体外模型。心肌细胞持续活力测定方面,细胞培养液中的肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和谷草转氨酶(AST)酶活均受到培养时间的影响(P<0.05)。CK和LDH酶活有着相似的趋势,在第6天酶活最低,之后逐渐升高。AST酶活随培养时间的延长而增加且在第9天达到最大。心肌细胞的活力可持续6天,之后酶活随培养时间的延长而降低。试验二:研究热应激对原代培养鸡胚心肌细胞的影响,旨在确定原代培养鸡胚心肌细胞受到热应激影响的最佳时间点。采用2×5两因子完全随机设计。试验设2个培养温度(40℃常温和44℃高温)和5个作用时间(1、2、4、6和8 h),共10个处理,每个处理6个重复。在高温条件下,鸡胚心肌细胞培养液中CK、LDH和AST的酶活性显著(P<0.05)升高,表明心肌细胞结构的完整性发生了改变。在高温条件下,与常温相比,高温极显著的(P<0.05)上调了心肌细胞HSF1、HSF2 mRNA、HSP70和HSP90基因表达。心肌细胞中HSP70和HSP90 mRNA的表达先升高、后降低,且分别在2 h和4 h时达到最大。HSP70和HSP90蛋白表达随热应激时间的延长而升高。面对高温热应激,心肌细胞HSP70和HSP90 mRNA比其相应的蛋白表达反应更灵敏。以上结果表明,HSP70和HSP90基因在体外培养原代鸡胚心肌细胞内的表达对热应激敏感,在鸡胚心肌细胞对抗或缓解热应激损伤中发挥重要作用。最后,热应激处理2 h和4 h为心肌细胞最佳热应激持续时间点,为后续试验四热应激处理时间点提供了试验依据。试验三:研究锰水平对原代培养鸡胚心肌细胞mnsod活性及其基因表达的影响,旨在确定原代培养鸡胚心肌细胞最佳锰加添水平及孵育时间。采用5×3两因子完全随机试验设计,设5个锰添加水平(0、0.5、1、2和4mm氯化锰形态的锰)与3个锰孵育时间(12、24和48h),共15个处理,每个处理6个重复。锰水平和孵育时间对鸡胚心肌细胞mnsod酶活有极显著的互作效应(p<0.05)。在12h时,锰水平对mnsod酶活性没有影响(p>0.05),而在24h和48h时,与对照组和0.5mmmn相比,1mmmn显著提高了mnsod酶活性(p<0.05)。mnsodmrna表达水平上,锰和孵育时间均提高了mnsodmrna基因的表达(p<0.05)。与对照组相比,添加1mm锰显著(p<0.05)提高了心肌细胞mnsodmrna表达。与作用12h相比,作用24和48h均上调了(p<0.05)mnsodmrna基因的表达。以上结果表明,在鸡胚心肌细胞中,锰诱导的mnsod基因表达的调控可能发生在转录和翻译后水平,或者通过修饰合成的mrna和蛋白的稳定性而发挥作用。结合上述结果,选取1mm锰添加水平并孵育48h,为试验四心肌细胞锰处理浓度和孵育时间提供了试验依据。试验四:研究锰对原代培养鸡胚心肌细胞的抗氧化性能及热休克蛋白/因子的影响,以揭示锰对鸡胚心肌细胞的抗热应激效应及其分子机制。试验采用2×3×2三因子完全随机设计。设2个鸡胚心肌细胞培养温度(40℃常温和44℃高温)、3个锰处理(不添加锰、添加1.0mm氯化锰形态的锰以及1.0mm中等络合强度有机锰形态的锰)与2个热应激处理时间点(2h与4h),共12个处理,每个处理6个重复。高温热应激显著提高了(p<0.05)心肌细胞mnsod酶活,mnsod、hsp70、hsp90、hsf1、hsf2和hsf3mrna表达,hsp70蛋白表达,表明热应激引起了心肌细胞氧化损伤。与对照组相比,细胞培养液中加无机锰和有机锰均提高了(p<0.05)心肌细胞mnsod酶活性,且有机锰显著的(p<0.05)高于无机锰。在mnsod基因表达方面,锰源与培养温度有极显著(p<0.05)的互作效应。在常温条件下,无机锰和有机锰均提高了(p<0.05)心肌细胞mnsod基因表达。在高温热应激条件下,与对照组和无机锰组相比,有机锰显著的(p<0.05)上调了心肌细胞mnsodmrna表达。加锰特别是有机锰显著的(p<0.05)增加了mnsod蛋白表达。锰源与培养温度的交互作用显著的(p<0.05)影响了hsp70基因的表达和hsp90mrna表达。在常温条件下,锰对hsp70基因表达和hsp90mrna表达无影响(p>0.05)。在高温热应激条件下,无机锰和有机锰均下调了(p<0.05)hsp70和hsp90mrna表达,且有机锰的下调程度显著(P<0.05)高于无机锰。不论无机锰还是有机锰均降低了(P<0.05)HSP70蛋白表达。然而,加锰显著地提高了(P<0.05)HSP90蛋白表达。以上结果表明,细胞培养液中加锰特别是中等络合强度有机锰可提高心肌细胞抗氧化能力,降低热应激引起的氧化损伤。试验五:研究锰对原代培养鸡胚心肌细胞表观遗传的影响。试验设计同试验四。加无机锰和有机锰均降低了(P<0.05)心肌细胞MnSOD和HSP70启动子区DNA甲基化水平,可能与其MnSOD mRNA高表达有关。高温组上调了(P<0.05)心肌细胞gga-miR-34c-5p,gga-miR-29c-3p表达,下调了(P<0.05)gga-miR-10a-5p,gga-miR-10b-5p,gga-miR-125b-5p表达。无机锰和有机锰均上调了(P<0.05)心肌细胞ggamiR-142-5p,gga-miR-34b-5p,gga-miR-34c-5p,gga-miR-29c-3p,gga-mi R-10a-5p,gga-miR-10b-5p,gga-mi R-125b-5p表达。以上结果表明,锰可通过修饰特定基因启动子区DNA甲基化程度以及相应的miRNA表达以调控靶基因的表达及其相关通路来缓解高温应激造成的氧化损伤。综上所述,本研究发现心肌细胞培养液中加锰、特别是中等络合强度有机锰,可提高心肌细胞抗氧化能力,有效缓解热应激引起的氧化损伤,而且锰可引起心肌细胞特定基因启动子区DNA甲基化和miRNA表观遗传变化,并调控相应的功能基因。