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斑节对虾是沿海地区重要水产养殖品种之一,对于水产经济的发展贡献极大。由于养殖环境恶化及各类病毒、细菌性疾病的爆发,斑节对虾养殖所面临的挑战前所未有的严峻。通过了解其先天性免疫防御机制,采取有效手段增强其抗病力是重要的解决方法。作为无脊椎生物,对虾主要依靠先天性免疫途径来进行免疫调控与防御,而Toll样受体是对虾先天性免疫系统的重要组成部分。Toll样受体是先天性免疫模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)中重要一员,主要免疫方式是通过抵御外源病原微生物的入侵进而发挥免疫功能。Toll样受体可识别特异性病原相关分子模式(Pathogen associated molecular pattern,PAMP),可将病原感染信号转入胞内,形成信号级联反应再传递到核内,实现各类免疫分子的转录、表达与释放,并显著激活先天性免疫系统。斑节对虾Toll受体免疫机制的研究有助于深入了解对虾抵御病原反应的具体机制。本研究以斑节对虾Toll9基因ORF全长为模板,首次以哺乳动物细胞和果蝇细胞构建免疫模型来探究PmToll9对于TLR/Toll信号通路的调控及应对病原的免疫特性,并对其蛋白序列进行了结构预测与生物性分析。体外结合病原实验证明PmToll9可识别部分革兰氏阴性菌,并可以广谱性识别PAMPs;体内微生物侵染证明革兰氏阳性菌可刺激PmToll9上调表达,而革兰氏阴性菌具有抑制表达作用。基于细胞免疫模型,应用各种检测技术发现PmToll9可通过激活NF-κB启动子的活性实现对TLR信号通路的调控,并通过激活抗菌肽表达促进Toll通路信号分子的转导,同时介导TLR/Toll通路下游因子的差异性表达,证明PmToll9可参与免疫系统的调控。免疫刺激实验证明LPS、Poly(I:C)-HMW、Poly(I:C)-LMW、R848、ODN2006、CL097、Rec FLA-ST和Peptidoglycan等配体并不能被PmToll9直接识别,说明PmToll9识别配体可能需要介质因子Spatzle的存在。缺失突变体实验证明缺失LRR区域后,PmToll9对NF-κB的激活能力会显著降低,其中缺失LRR4和LRR10/11/12的突变体对NF-κB的激活能力下降的最为显著,LRR4和LRR10/11/12可能是PmToll9关键功能结构域。具体研究成果阐述如下:1.PmToll9原核表达和结合特性分析经验证,相比IPTG诱导表达,自诱导表达系统更适用于PmToll9和胞外区重组蛋白的分离纯化及相关功能研究。ELISA实验显示Toll9-ED蛋白对Poly(I:C)-LMW/HMW、ODN2006、LPS和Resoquimod等PAMPs均具有较强的结合活性,表明Toll9-ED蛋白具有广谱的PAMPs识别活性;PmToll9-ED对部分革兰氏阴性菌有明显的结合能力,而对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)结合能力较弱,说明PmToll9可能是通过结合PAMPs来识别和抵御部分革兰氏阴性菌感染。斑节对虾体内细菌刺激实验结果显示无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)可激活斑节对虾肝胰腺、肠、淋巴和鳃组织中PmToll9的表达,哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)可显著抑制PmToll9在肝胰腺中的表达。提示革兰氏阳性菌S.agalactiae可通过PmToll9激活Toll信号通路,引起机体免疫防御反应,而革兰氏阴性菌V.harveyi对此过程具有一定抑制作用。2.PmToll9对哺乳动物TLR信号通路的诱导结构分析发现PmToll9胞外区有12个亮氨酸富集区(LRRs),不含信号肽序列,但含有12个N-糖基化预测位点和119个预测的磷酸化位点;其胞内区与果蝇Toll9、冈比亚按蚊Toll9等物种TIR区域相似度最高。PmToll9空间结构为马蹄状,其凹面区形成光滑且弯曲的β折叠结构,推测参与配体识别。免疫印迹方法证实PmToll9重组真核蛋白可在HEK293T细胞中成功表达;Dual-luciferase检测发现PmToll9显著激活NF-κB启动子的活性,未能激活ISRE与IFN-β启动子,且在200ng转染浓度处PmToll9对NF-κB报告基因的激活效果显著。qRT-PCR数据证明PmToll9成功激活HEK293T细胞TLR信号通路,促进通路下游因子MyD88、TRAF-6、IL-8、IL-10、IκB-α的上调表达,同时ELISA结果证明PmToll9可促进TNF-α蛋白表达水平显著上调。缺失突变体的构建表明LRR缺失突变可以导致PmToll9对NF-κB激活能力降低,其中缺失LRR4和LRR10/11/12的突变体呈现出更显著的表达下调作用,说明LRR4和LRR10/11/12区域可能是PmToll9介导信号传递的关键功能域。Hela细胞定位实验显示PmToll9-GFP重组蛋白主要位于细胞质中。3.Toll9在果蝇Toll通路的激活表达以果蝇S2细胞构建了体外表达模型,报告系统显示PmToll9可以明显激活果蝇抗菌肽Drosomycin和对虾抗菌肽PEN 453、PEN 536和crustin-like的表达,并促进下游因子Tube/Cactus/Dorsal/Dif/Drosomycin等表达水平的升高,说明PmToll9可通过激活抗菌肽的表达促进Toll通路相关信号分子的转导。免疫刺激实验显示果蝇S2细胞经Peptidoglycan(PGN)、poly(I:C)-LMW和poly(I:C)-HMW刺激后,报告基因被显著激活,果蝇Toll通路下游因子Tube/Cactus/Dorsal/Dif/Drosomycin呈现差异性表达。基于上述结果,推测PmToll9激活的信号分子转导路径为Toll/Sp?tzle/NF-κB/Tube/Cactus/Dorsal/Dif/Drosomycin。LRRs缺失突变说明LRR3/4/10/11/12等区域可能具有特殊位点,对PmToll9的配体识别过程具有重要作用。本研究应用多种生物技术探究了PmToll9对哺乳动物系统TLR信号通路和果蝇系统Toll信号通路的调控及应对病原的免疫特性,且取得了一定的研究成果,为以后更加深入的研究斑节对虾抗病机制奠定了理论基础。