基于活体细胞的真菌杀虫菌剂时效性较差,限制其商业开发和应用。生防真菌转基因工程菌剂在很大程度能克服杀虫时效性较差的缺点,但绕不开环境安全性的公众疑虑,而目前缺乏转基因真菌杀虫剂田间杀虫效果和安全性评价的实例。本研究以先前构建的超高表达苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)杀虫蛋白Vip3Aal而对鳞翅目害虫表现高胃毒杀虫活性的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)工程菌株BbHV8及其亲本野生株Bb2860(简称WT)为材料,将其高纯度分生孢子粉配制成孢子悬乳剂(emulsifiable formulation),在浙江金华从初夏开始进行了两个独立的各历时35天防治以菜青虫(Pieris rapae)为主、小菜蛾(Plutella xylostella)和桃蚜(Myzus persicae)为辅的田间试验,一是比较两种菌剂与当家化学杀虫剂甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(简称甲维盐)在根据虫情四次用菌用药条件下对卷心甘蓝的整季保护效果；二是在试验期间评价了各处理对田间捕食性天敌蜘蛛种群的影响,试验之后数月期间多批次采样评价两种菌剂在释放环境中的存留状况、环境适应性及其对土壤真菌群落的影响,作为其环境安全性的评判依据。在此基础上,探索了利用工程菌中靶基因的引物在实时定量荧光PCR中的特异性,通过制定标准曲线快速定量检测甘蓝叶片上和环境土壤样品中工程菌含量的可能性,为工程菌剂的环境安全性评价和管控提供技术参考。主要结果摘要如下：工程菌剂BbHV8对甘蓝的整季保护效果与甲维盐匹敌在夏季由水稻和玉米作物包围的两地块中分别于4月2日和12日移载的甘蓝,很快诱集菜粉蝶等鳞翅目害虫前来产卵,田间菜青虫分别于4月22日和5月5日达到0.94±0.06和0.93±0.05头/株甘蓝(mean±SEM)的虫口密度,大大超过0.5头/株的经济危害阈值,故作为试验1和试验2用菌用药处理的起始日。两试验均包括4个处理,即BbHV8和WT的悬乳剂(1010个孢子/mL)100倍稀释液机动弥雾(用菌量均为1013个孢子/公顷)、5%甲维盐水分散粒剂按标签用量机动弥雾(标准化防)及配制孢子悬乳剂的乳油100倍稀释液机动弥雾(空白对照),每处理4个小区(6×11m),随机区组排列。试验1首次弥雾后间隔10天重复用菌用药,每隔5天抽样调查各处理中菜青虫、小菜蛾及蚜虫密度,第25天对照中菜青虫虫口达16.1±1.0头/株,而BbHV8、WT及甲维盐处理中分别为4.3±0.3、8.2±0.8和1.3±0.2头/株；首次药后20天,在BbHV8、WT、甲维盐和对照中小菜蛾虫口分别0.40±0.08、0.45±0.06、0.75±0.06及1.50±0.15头/株,第35天分别为0.15±0.05、0.28±0.09、1.95±0.64及0.13±0.05头/株。试验1中桃蚜初始密度为12.7±1.1头/株,首次药后15天甲维盐处理区蚜虫数量上升,第35天68.6±3.2头/株,而同期BbHV8处理区仅为10.9±1.5头/株。试验2的虫情与试验1相近,但对照处理菜青虫密度于第10天高达27.7±2.0头/株,于是分别在首次药后第5天和第15天重复用菌用药,最终试验2各处理的控虫效果优于试验1。由于两试验中都是暴食性菜青虫主导危害甘蓝,对照叶片损毁十分严重,且被损毁植株上的菜青虫就近转移到可取食的植株,使田间抽样调查的虫口数难以真实反映甘蓝受害状况,故调查时根据每株甘蓝叶片损失率分为5级,作为各处理相对防效和综合保护效果的评价依据。结果表明,试验1中BbHV8、WT和甲维盐历次抽样调查的相对防效分别为65～75%、15～58%和42～85%,平均防效分别为70.5%(±1.2)、30.9%(±6.1)和69.7%(±6.9)。试验2期间上述三处理的相对防效波动范围分别为49～80%、41～70%和51～90%,平均防效分别为74.5%(±4.3)、48.4%(±4.2)和83.5%(±5.5)。两个试验中,工程菌剂BbHV8与甲维盐的总体防效相似或相近,都显著高于WT。后者对害虫有一定的控制作用,但当菜青虫暴发时,难以及时控制虫口数量而对甘蓝予以有效保护。在试验2期间补充进行了两种菌剂相同用菌量下对暴食性4龄菜青虫的田间生物测定,测得BbHV8对4龄菜青虫的LT50和LT95分别为1.6(1.2～1.9)和4.5(4.3～4.8)天,而WT的LT50和LT９5分别为5.7(5.4～6.0)和11.5(10.6～12.8)天。这一结果说明,BbHV8毒杀4龄菜青虫50%和95%比WT分别快4天和7天。工程菌剂BbHV8的生态安全性在田间试验1和2期间的历次抽样调查中,BbHV8和WT菌剂处理对田间蜘蛛种群均未见负面影响,BbHV8由于较好保护了甘蓝,对田间蜘蛛种群有所助增,而甲维盐处理区蜘蛛数量一直低于菌剂处理区。在试验1最后一次用菌后次日、30天内每隔10天、半年内每隔一个月采集用菌和对照处理小区的表层土壤(0-5cm),带回实验室分别选择性分离培养球孢白僵菌与腐生丝状真菌并统计每克土样中的菌落形成单位(CFU)数量。结果显示,WT和BbHV8小区喷菌后次日每克土壤(干重)中球孢白僵菌CFU含量分别达3.1(±0.4)×104和2.1(±0.4)×104个,10天后降为4.3(±0.2)×103和3.2(±0.2)×103个,20天后降为3.8(±0.7)×102和4.1(±0.8)×102个,此后低水平徘徊,第120天后分别降至145±59和36±36个,再往后采集的土样中再未分离到球孢白僵菌。对照小区中仅在用菌后第20和30天的每克土样中分离到69±40和34±34个CFU,显示田间雨水等因素可导致白僵菌在地块内的轻微扩散。各批次土样中分离培养的腐生真菌CFU数量虽有季节性变化,但同批次样品中的CFU含量在两菌剂与对照处理间均无显著差异。将用菌后30天、60天和90天的球孢白僵菌土壤分离物各选24株共72株,每次来自BbHV8和WT小区的各12株,通过PCR检测它们是否携带杀虫蛋白基因vip3Aal基因。结果显示,来自用菌后30天WT小区的12株菌有2株呈阳性,而源于BbHV8小区的12株菌中也有2株呈阴性；用菌后60天的分离物鉴定结果,来自WT处理小区的白僵菌全为阴性,来自BbHV8小区的仅有1株呈阴性；用菌后90天的土样分离株中,来自BbHV8小区的全为阳性,而来自WT小区的全为阴性。显然,所用菌剂由于雨水泾流等原因在地块内存在扩散或相互串染的现象,但串染率不超过17%,且随着田间存留量的减少,串染比率降低,最后消失。用菌后90天BbHV8和WT小区的土壤分离株rHV8和rWT在SDAY平板上培养8天的产孢量分别比BbHV8和WT下降26.5%和32.4%,而且rHV8培养8天的菌落直径比BbHV8小32.2%；rWT虽比WT生长快9.1%,但菌落产孢量大幅下降。环境胁迫试验表明,BbHV8分生孢子耐UV-B辐射和45℃高温的能力分别比WT低19.2%和12.5%,rHV8比BbHV8分别低32.5%和38.9%,rWT比WT分别低39.7%和31.0%。总体看,BbHV8和Bb2860在释放环境中的生态适应能力呈下降趋势,且前者的生态适应能力弱于后者。工程菌剂BbHV8在释放环境中存留量的快速定量检测技术探索通过实时荧光定量PCR扩增融解曲线对靶基因vip3Aal引物特异性的分析建立扩增标准曲线,利用靶基因在BbHV8细胞中单拷贝的特性,以含分生孢子的甘蓝叶片和土壤样品的总DNA提取物为模板,探索建立甘蓝和土壤样品中孢子含量的快速检测方法。结果显示,菜叶上孢子的检测精度可达2个孢子/mm2,土壤中也可检出1-2个孢子/mg干土。然而,土壤成份复杂,影响目标DNA的提取效率和PCR扩增效率,样品检测偏差大于甘蓝叶片。综上所述,BbHV8转基因工程菌剂对甘蓝主要害虫的防治效果与甲维盐相似或相近,对非靶标的田间蜘蛛和土壤真菌群落无负面影响,其在释放环境中的存留量快速衰减,生态安全风险很低。