背景与目的肠上皮细胞(intestinal epithelial cells, IEC)和肠上皮间淋巴细胞(intraepithelial lymphocytes, IELs)之间的相互作用在肠上皮的生长、结构和功能维持方面发挥着重要作用。角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor, KGF)属于成纤维细胞生长因子家族成员,在肠道组织中由黏膜层的γδ上皮间淋巴细胞(γδ intraepithelial lymphocytes, yδ-IELs )分泌产生,与胶质细胞生长因子受体(keratinocyte growth factor receptor, KGFR)结合后以旁分泌的形式促进肠上皮细胞的生长和增殖。我们之前曾经报道过,在体内实验中,给小鼠腹腔注射外源性的KGF后,KGF可以通过促进肠上皮细胞的增殖来缓解小肠缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)带来的损伤以及辐射诱导的肠道损伤,从而起到保护肠道的作用。研究还表明,在胃肠道中KGFR的表达量非常丰富,这些发现提示消化道不仅可以合成、分泌KGF,而且可以对KGF产生反应。最近有学者使用斑马鱼模型进行研究发现,芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor ,AhR)在KGF诱导的组织再生中具有重要作用。进一步研究发现,在鼠科动物的3T3成纤维细胞中,AhR的表达可以受到成纤维细胞生长因子家族成员(fibroblast growth factor,FGF)的调控。这些研究都提示我们,内源性的AhR可能参与到了 FGF介导的信号通路中,从而在细胞或组织的生长、增殖中发挥作用。AhR作为一种DNA结合蛋白,由805个氨基酸构成,属于碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)超家族,在人体多种器官和组织、细胞中都有表达。非配体化的AhR在胞浆中可以和热休克蛋白90 (heat shock protein,HSP90)结合形成一个稳定的复合体,当AhR被其内源性或外源性配体激活后遂与HSP90分离,AhR-配体复合体转移到核内并迅速与AhR核转位子(AhRnucleartranslocator,ARNT)结合到二噁英反应元件上,进而反式激活编码异性生物质代谢酶Ⅰ、Ⅱ的基因,比如细胞色素P450s。近几十年来,大家已经围绕AhR介导的毒性效应进行了大量的研究。越来越多的证据表明,AhR可能在受体介导的信号通路中扮演着重要角色。比如,Lee等人曾经在野生型和AhR基因敲除型(AhR-/-)小鼠的RoryT+细胞中通过微阵列芯片分析技术发现Notch1是AhR的一个下游作用靶点。另外,Qiu等人研究发现,通过敲除AhR基因可以明显降低白介素7受体α(Interleukin-7 receptor α,IL-7Rα)的表达,Kiss等人也曾经报道称在敲除AhR基因的固有淋巴细(innate lymphoid cells, ILCs)中,编码具有酪氨酸蛋白激酶活性的生长因子受体的原癌基因cKit的表达量显著下降。基于这些发现,我们推测内源性的AhR可能是通过调节KGFR的表达从而影响KGF介导的信号通路的。方法:一、成年(6-8周)C57BL/6J小鼠和C57BL/6J AhR-/-小鼠均被随机分成四组:对照组、KGF干预组、AhR-/-+KGF组、AhR-/-组,每组包括6只小鼠。KGF药物干预第五天处死小鼠并取小肠进行分析。通过增殖细胞核抗原(Proliferati ng Cell Nuclear Antigen,PCNA)免疫组织化学来检测上皮细胞(epithelial cell,EC)的增殖情况,通过苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色来反映小肠的组织形态学变化,通过检测绒毛高度、隐窝深度、小肠湿重、RNA及蛋白质含量等指标来反映不同组别小肠的变化。二、通过免疫印迹(western blot,WB)技术检测成年(6-8周)C57BL/6J小鼠和C57BL/6J AhR-/-小鼠的小肠上皮AhR蛋白表达水平,从而评估AhR基因敲除效果。通过WB和实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time Polymerase Chain Reaction,Real-time PCR)技术来检测对照组和AhRKO组小肠上皮中KGFR的表达水平。三、使用针对AhR的小干扰RNA(siAhR)沉默LoVo细胞中的AhR基因,细胞分为对照组、转染siNC组、siAhR组等三组。AhR的表达通过WB检测,KGFR的表达水平通过WB和Real-timePCR检测。分别提取核蛋白和总蛋白后,通过WB检测E2F1的表达水平。四、使用针对E2F1的小干扰RNA(siAhR)沉默LoVo细胞中的E2F1基因,细胞分为三组,即对照组、转染siNC组、siE2F1组,利用WB技术检测三组细胞中E2F1和KGFR的表达水平。五、对LoVo细胞进行KGF和/或siAhR干预处理,分为四组,即DMSO组、KGF干预组、siAhR干预组、KGF+siAhR组。通过细胞计数和流式细胞周期分析等实验手段对LoVo细胞进行增殖方面的研究。结果:1、与对照组相比,KGF干预组的小肠组织PCNA阳性细胞数量显著升高,而AhR-/-组KGF诱导的肠上皮增殖细胞数量显著降低。与KGF干预组相比,敲除AhR基因导致空肠的绒毛高度显著下降、隐窝深度显著变浅,小肠湿重以及RNA、蛋白质的含量也明显降低(*P<0.05)。2、经检测AhR-/-组小鼠小肠上皮组织内AhR含量可以发现AhR已成功敲除。生理状态下,无论是蛋白水平还是mRNA水平,敲除AhR基因都导致了肠上皮细胞内KGFR的表达量显著降低(*P<0.05)。3、通过WB检测AhR的表达水平发现,在使用siAhR的组中,AhR基因被成功沉默。WB及Real-timePCR结果显示,与对照组相比,AhR基因沉默的细胞KGFR在蛋白水平和mRNA水平均显著降低。利用WB检测E2F1蛋白表达水平发现,在核蛋白中,siAhR组E2F1与其他组相比,表达水平显著降低,而在总蛋白中,三组表达水平并无显著性差异(*P<0.05)。4、利用WB检测E2F1蛋白发现LoVo细胞被成功转染siE2F1 。WB及Real-timePCR结果显示,E2F1基因沉默的细胞内KGFR的表达水平与其他组相比显著下降(*P<0.05)。5、通过细胞计数发现,KGF组的细胞数量显著高于其他组。流式细胞周期分析结果显示KGF组被阻滞在G0/G1期的细胞数量显著低于其他组,而处于S期的细胞数量则显著高于其他组(*P<0.05)。结论:1、AhR基因敲除的小鼠对KGF诱导的小肠上皮细胞增殖缺乏敏感性。2、敲除AhR基因以后,小鼠小肠上皮细胞内KGFR的表达量显著下降。3、体外实验中上皮细胞内KGFR的表达量受到AhR-E2F1信号通路的调控。4、AhR基因沉默的LoVo细胞对KGF诱导的上皮细胞增殖缺乏敏感性。5、AhR-E2F1-KGFR信号通路参与了 KGF诱导的小肠上皮细胞增殖。