糖尿病肾病(DN)是糖尿病患者最常见的并发症之一。2013年,一项发表在美国医学会杂志的最新研究数据表明,我国成年人的糖尿病患病率已达11.6%,成年人糖尿病前期患者已达人群的50.1%。DN早期症状主要表现为浮肿和微量白蛋白尿,肾脏病理改变主要为肾小球肥大,肾小球基底膜增厚,系膜区有大量基膜样物质增生,最终发展为肾小球硬化、纤维化。临床上,糖尿病患者一旦发生肾脏改变,出现持续蛋白尿则病情不可逆转,直至进展为期末期肾功能衰竭。因此,DN已成为糖尿病患者,尤其是年轻病人死亡的重要原因,对DN发病机制及临床诊疗方法的研究有着非常重要的意义。但由于糖尿病肾病病因的复杂性,目前国内外对糖尿病肾病发生的分子机制仍未完全阐明。MicroRNA是长约20-24个核苷酸,内源性、非编码的小RNA分子,是一种广泛存在的对基因表达进行调控的分子。近年有研究发现microRNA在基因中的调控作用与糖尿病肾病的发生发展关系密切。研究糖尿病肾病与microRNA的关系,将为理解糖尿病肾病的发生发展提供新的观点,并可能为糖尿病肾病的早期诊断提供生物标记,为其治疗和干预提供新的靶点。本研究围绕内分泌疾病中的难点及重点：糖尿病肾病发生的分子机制进行选题,以糖尿病肾病小鼠动物模型和高糖培养的小鼠肾小球系膜细胞为研究载体,通过基因芯片检测、RT-PCR, Western-Blot.免疫组化等方法,研究了糖尿病肾病中差异表达的miR-346在糖尿病肾病的发生发展对抗TGF-β/Smad信号途径的分子机制,并通过外源性给予miR-346探讨了miRNA对糖尿病肾病进展的影响及可能机制,为进一步拓展研究糖尿病肾病的早期特异性诊断和治疗提供了理论依据。本研究主要包括以下三个部分：第一部分糖尿病肾病小鼠miRNAs差异分析及验证目的：建立糖尿病肾病小鼠动物模型,分析miRNAs的差异表达谱,为进一步探讨miRNAs在糖尿病肾病发生机制中的作用提供依据。方法：采用db/db小鼠作为2型糖尿病肾病动物模型(DN组),db/m小鼠为正常对照。在小鼠4、8、12、16周龄时,分别测定两组小鼠体重、空腹血糖及24小时尿蛋白量。开腹取出两侧肾脏,清除肾门处血管等结缔组织,称质量。每个肾脏分别从中线剖开,切细肾组织,一部分肾组织10%中性甲醛固定后,石蜡包埋切片,切片厚2μm,行PAS染色,光镜下观察肾组织的病理改变,另一部分肾脏组织液氮保存用于RNA的提取。Trizol法抽提肾脏总RNA,紫外分光光度计检测总RNA的纯度,甲醛变性胶电泳评估总RNA的质量。从8周龄的DN组和正常对照组小鼠中随机抽取3例,肾脏组织总RNA经小RNA分离后,分别用Cy3和Cy5标记,然后用含1181个探针的miRNAs芯片分别检测糖尿病肾病组和对照组miRNAs的表达谱,分析miRNAs差异表达谱。使用Exiqon miRNAs芯片对杂交后的芯片进行图像扫描。为进一步验证芯片检测差异表达miRNAs的准确性,以6只db/m对照组小鼠和6只db/db小鼠肾脏组织的cDNA为模板,利用TaqMan(?) microRNAs Assays实时荧光定量PCR试剂盒对部分miRNAs进行验证。应用miRNA靶基因在线预测软件TargetScan及PicTar搜索miRNA-346预测的作用靶基因,结合NCBI文献检索,对靶序列进行综合分析。结果：自4周龄,db/db小鼠的平均体重、血糖均显著性高于正常对照组(均P<0.05)；自8周龄时,DN组小鼠UAE显著性高于正常对照组(均P<0.05)。此后,随着周龄的增长,db/db小鼠体重、血糖和24h尿蛋白进一步上升。肾脏病理显示,16周龄时db/db小鼠出现肾小球肥大、肾小球系膜细胞明显增生、基质大量积聚及K-W结节等典型的DN病理改变,而对照组肾脏组织未见异常改变。对8周龄db/db小鼠miRNAs芯片检测数据分析,在含1181个探针miRNA芯片检测中共发现有772个miRNA在糖尿病肾病组中表达,433个miRNAs在对照组表达。两组差异倍数大于4倍的miRNAs共有73个,其中在DN组织中升高的有39个,降低的有34个。利用定量RT-PCR对部分miRNAs进行验证,结果表明miR-215、miR-451、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-21、 miR-346、miR-709和miR-187在糖尿病肾病组中表达降低,降低倍数从1.89至12.32,而miR-29c、miR-192、miR-216a、miR-17、miR-377、miR-196a、miR-166、和miR-98在糖尿病肾病组高表达,升高倍数从1.98至10.12,定量RT-PCR结果与芯片结果趋势一致。本课题选择miR-346作为研究目标。通过生物信息学技术,对miR-346靶基因进行预测,确定Smad3/4基因为miR-346的靶基因。结论：部分miRNAs在糖尿病肾病与正常肾脏组织中存在差异表达,其中,miR-346在糖尿病肾病组中表达显著降低,可能参与了糖尿病肾病发生的分子机制。miR-346的靶基因为Smad3/4。第二部分miR-346对TGF-β介导Smad信号通路的影响目的：研究miR-346在TGF-β信号通路介导的糖尿病肾病的发生发展中对TGF-β/P53信号途径关键分子的作用,为探索miR-346在调控糖尿病肾病的分子机制提供线索。方法：(1)采用糖尿病肾病db/db小鼠模型和db/m小鼠对照,16周时,分别通过免疫组化、免疫印迹及RT-PCR检测两组动物肾皮质TGF-β、P53、miR-346及Smad3/4表达水平的变化；(2)在高糖浓度培养的小鼠肾小球系膜细胞,先给予重组TGF-β药物(10、30 ng/ml)刺激,再以RNA干扰降低TGF-β的表达量,通过免疫印迹、RT-PCR法分别检测两种干预后P53、Smad3/4、miR-346的表达水平；(3)将高糖浓度培养的小鼠肾小球系膜细胞分为三组,分别给予重组TGF-p药物刺激、P53 RNA干扰及重组TGF-β药物刺激+P53 RNA干扰,通过免疫印迹、RT-PCR法分别检测各组Smad3/4 mRNA及蛋白水平、miR-346表达水平；(4)构建miR-346表达质粒,在小鼠肾小球系膜细胞中,先共转miR-346表达质粒,再加入重组TGF-β药物,然后以免疫印迹、RT-PCR法分别检测两种干预后Smad3/4 mRNA及蛋白水平。结果：(1)在db/db小鼠动物模型,TGF-β、P53及Smad3/4的表达显著性高于正常对照组,而miR-346显著性低于正常对照组；Smads家族其他基因如Smadl、Smad2、Smad5、Smad7及Smad8表达量并没有变化,统计学无差异(P>0.05)；(2)在小鼠肾小球系膜细胞,给予重组TGF-β药物(10、30 ng/ml)刺激后,P53 mRNA及蛋白显著上升,Smad3/4 mRNA及蛋白水平显著上升,miR-346的表达水平显著下降；通过RNA干扰降低TGF-P表达后,P53mRNA及蛋白水平显著下降,Smad3/4 mRNA及蛋白水平显著下降,miR-346表达水平显著增加(P<0.05)；(3)在小鼠肾小球系膜细胞,同时给予重组TGF-β药物刺激+P53 RNA干扰后,Smad3/4 mRNA及蛋白水平显著下降,与单纯TGF-β药物刺组具有显著差异(P<0.05)；(4)在小鼠肾小球系膜细胞中共转染miR-346表达质粒,Smad3/4 mRNA及蛋白水平显著下降,再加入重组TGF-β后,Smad3/4 mRNA及蛋白水平又显著回升。结论：DN状态时TGF-β、P53及Smad3/4的表达显著升高,而miR-346显著性降低；TGF-β可通过P53特异性下调miR-346的表达,间接上调细胞内Smad3/4的表达量,以促进糖尿病肾病的发生及发展。第三部分miR-346靶向治疗糖尿病肾病的体内研究目的：通过体内研究miR-346对糖尿病肾病发病的影响,以及肾小球形态学和TGF-β/P53信号途径关键分子的变化,为探索miR-346治疗糖尿病肾病提供思路。方法：采用db/db小鼠动物模型,随机分为三组：pGenesil-miR-346质粒处理组、对照空质粒pGenesil-1处理组及未处理组；前两组自第8周每天尾静脉注射质粒30mg/kg/d,连续两周,未处理组不注射。光学显微镜下观察肾小球形态大小,RT-PCR及免疫印迹检测肾脏组织TGF-β、P53、Smad3/4的mRNA及蛋白表达水平。结果：治疗组、对照空载组及未处理组小鼠4、8、12、16周龄小鼠平均体重及随机血糖各组间无显著性差异(均P>0.05)；治疗组小鼠第8周治疗后,12周、16周尿UAE分别为108.96、82.14μg/24h,均显著性低于对照组和空载组(均P<0.05)。16周时,光镜下观察发现,注射miR-346重组质粒组db/db小鼠的肾小球损害明显低于注射对照空质粒和未注射质粒的db/db小鼠,肾小球结构完整,系膜增厚程度轻。RT-PCR及免疫印迹结果显示,注射miR-346重组质粒后db/db小鼠的Smad3/4mRNA及蛋白表达水平显著低于注射对照空质粒组(P<0.05),而对TGF-β及P53 mRNA及蛋白水平无影响作用(P>0.05)。结论：miR-346可能通过特异性靶向调控Smad3/4信号传导途径,抑制糖尿病肾的进展,因而可能成为糖尿病肾病的一个新的潜在治疗靶点。综上,本课题紧密结合糖尿病肾病发生的分子机制,通过建立糖尿病肾病小鼠动物模型及筛查miRNAs的差异表达谱,系统探讨了与糖尿病肾病相关的miR-346在糖尿病肾病小鼠模型及小鼠肾小球系膜细胞中对TGF-β/Smad信号途径关键分子的变化的影响,为进一步探索miR-346靶向治疗糖尿病肾病提供理论基础。本研究通过基因芯片检测与实时定量PCR验证,发现包括miR-346在内的部分miRNAs在糖尿病肾病肾脏组织中存在差异表达,证实miRNAs可能参与了糖尿病肾病发生的分子机制；采用生物信息学技术预测发现Smad3/4为miR-346的靶基因。采用实时定量PCR及免疫印迹检测,初步提示TGF-β可通过P53特异性下调miR-346的表达,间接上调细胞内Smad3/4的表达量,从而促进糖尿病肾病的发生及发展。本研究表明,外源性给予糖尿病肾病小鼠miR-346质粒,可以特异性靶向调控Smad3/4的信号传导,改善小鼠的临床症状和病理改变,因此,miR-346可能是一个新的糖尿病肾病的潜在治疗靶点。这为今后特异性治疗糖尿病肾病提供了新的思路。