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研究背景：人肌纤生成调节因子-1(human myofibrillogenesis regulator 1, hMR-1)是本课题组克隆的一个人类新功能基因,它定位于人类染色体2q35,全长755bp,编码一段142个氨基酸组成的蛋白质。前期工作证实,MR-1高表达于心肌和骨骼肌,免疫组化证实人类心肌肌原纤维上有MR-1分布,血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)诱导肥大心肌细胞中MR-1表达显著升高,以RNA干扰(RNA interference, RNAi)下调MR-1表达后则降低AngⅡ诱导的心肌肥大效果,提示MR-1与心肌肥大有关。既往工作通过酵母双杂交和GST pull-down实验发现,MR-1与肌球蛋白调节型轻链(myosin light chain-2, MRLC)、myomesin-1和β-烯醇酶(β-enolase)等与肌肉收缩装置相关的蛋白间存在相互作用,提示MR-1可能通过调节心肌肌原纤维引起心肌肥大。不过,MR-1是否可以直接引起心肌肥大以及MR-1致心肌肥大的分子机制尚不清楚。研究目的：制备有效的抗MR-1抗体,构建MR-1真核表达质粒,建立MR-1沉默方法,在体外培养的乳大鼠心肌细胞模型上验证MR-1过表达直接引起肥大以及MR-1对心肌细胞肌原纤维生成与肌原纤维排列产生影响,阐明MR-1调节心肌肌原纤维改变的分子机制,旨在证实“MR-1通过促进肌原纤维生成引起心肌细胞肥大”。研究方法：1.抗体制备：生物信息学分析人类MR-1 (hMR-1)优势抗原肽,合成并混合后免疫家兔,抗血清以亲和层析法纯化后检测抗体的特异性及适用范围；质粒构建：根据NCBI GenBank数据库的hMR-1 mRNA信息克隆全长序列至pcDNA3.1-HisB(-)-Myc载体的多克隆位点；RNA干扰实验：根据大鼠源MR-1 (rMR-1)基因序列设计靶点并合成稳定修饰型stealth siRNA,筛选高沉默效率的MR-1-stealth siRNA.2.乳大鼠心肌细胞培养与心肌细胞肥大模型的建立：培养的乳大鼠心肌细胞以终浓度1×10-7mol／L的血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)孵育48h,以复制AngⅡ致心肌细胞肥大模型；专业图像软件分析细胞平均表面积、[3H]-亮氨酸掺入法检测细胞蛋白合成速率,以及RT-PCR法检测心房利钠因子(atrial natriuretic factor, ANF)、脑钠肽(brain natriuretic peptide, BNP)的转录水平,以证实心肌肥大的形成。3.肌原纤维生成(myofibrillogenesis)与排列观察：以FITC-鬼笔环肽特异性标记F-actin,观察横纹样F-actin的形成。4.细胞内信号分子检测：以细胞免疫荧光技术检测分子的亚定位、共定位及转位现象,以RT-PCR和Western Blot方法检测分子在mRNA和蛋白水平的表达。5.[Ca2+]i和钙调神经磷酸酶(calcineurin, CaN)活性检测：Fluo-3AM荧光探针标记胞浆Ca2+并半定量分析平均荧光强度,比色法检测CaN比活力。6.图像分析、数据处理及统计学分析：细胞平均表面积、条带积分光密度、[Ca2+]i平均荧光强度以专业图像软件Image Pro-Plus (version 4.11)进行半定量分析；各组实验数据以均数±标准差(x±s)表示,以统计学软件SPSS13.0分析,多组间两两比较用Bonferroni’s test,P<0.05认为具有显著性差异。实验结果1.制备了兔抗hMR-1多克隆抗体,可识别人源性及鼠源性MR-1抗原,适用于Western Blot和细胞免疫荧光实验。构建了MR-1真核表达质粒并在乳大鼠心肌细胞成功过表达外源hMR-1蛋白。根据沉默效率筛选stealth siRNA并转染乳大鼠心肌细胞,有效沉默了内源rMR-1表达。2.MR-1过表达引起心肌细胞肥大：细胞表面积、[3H]-亮氨酸掺入和ANF和BNP转录明显增加(P<0.05)；MR-1-RNAi对ANF和BNP的转录水平有所降低而对细胞表面积和蛋白合成速率无显著影响；此外,RNAi对AngⅡ诱导的三项肥大指标增加均明显逆转。3.MR-1过表达对心肌肌原纤维的影响：正常对照组心肌细胞F-actin呈“非横纹样(nonstriated-like)”和“非肌肉类型(nonmuscule-like pattern) ",主要沿胞膜内侧面分布；过表达MR-1组F-actin呈节段状,为典型的“横纹样”类型,且有25.0±6.7%的细胞肌原纤维呈紊乱排列,提示MR-1过表达促进肌原纤维生成(myofibrillogenesis)及其排列紊乱；MR-1-RNAi组F-actin呈“应力纤维样(stress fiber-like) ",与随机RNA对照组类似,并且MR-1-RNAi明显逆转了AngⅡ诱导的横纹样F-actin形成。4.对MR-1调节肌原纤维改变的分子机制研究：1)MR-1与MRLC共定位明显,均分布于胞浆并浓集于核周。在正常培养的乳大鼠心肌细胞中,MR-1与myomesin-1无共定位,但MR-1过表达引起myomesin-1转位至胞浆后,myomesin-1与胞浆的MR-1发生部分共定位。2)MR-1过表达明显上调myomesin-1和MRLC mRNA及蛋白的表达(P<0.05),MR-1-RNAi对myomesin-1和MRLC表达无显著影响,但逆转了AngⅡ引起的myomesin-1和上调。3)MR-1过表达促进myomesin-1的核-浆转位,MR-1-RNAi对转位无显著影响,但可在一定程度上抑制AngⅡ引起的myomesin-1转位。4)过表达SUMO-1引起myomesin-1核-浆转位,促进肌原纤维生成；抑制MR-1明显逆转SUMO-1过表达引起的myomesin-1转位及肌原纤维生成,提示MR-1可能在myomesin-1的SUMO化修饰及SUMO化介导的肌纤生成过程中发挥关键作用。5)MR-1过表达引起[Ca2+]i、CaN活性、肌细胞增强因子-2C(myocytes enhancer factor 2C, MEF-2C)和磷酸化-MEF-2C水平显著升高(P<0.05),MR-1-RNAi对这些无显著影响(P>0.05),但可逆转AngⅡ引起的升高。研究结论：1 MR-1过表达直接诱导乳大鼠心肌细胞肥大。2 MR-1通过促进肌原纤维生成及排列紊乱致乳大鼠心肌细胞肥大。3 MR-1通过调节myomesin-1与MRLC影响肌原纤维生成,从而引起心肌细胞肥大。(主要结论)4 MR-1可能在“Ca2+→CaN→MEF-2C”这一致心肌肥大的经典信号途径中发挥重要作用。