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研究背景:绵羊肺腺瘤病毒（Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV）是绵羊肺腺瘤病（Ovine Pulmonary Adenocarcinoma,OPA）的病原,OPA是一种羊传染性肺肿瘤疾病,在世界的很多地区均有该病的发生。由于在患有OPA的病羊体内检测不到特异性抗体,因此很难用常规的免疫学方法进行诊断。因为绵羊肺腺瘤病毒还未建立体外培养体系,所以常规的病毒分离鉴定方法无法用于该病的诊断。目前,该病主要通过病理解剖学、病理组织学和免疫组织化学方法诊断。研究目的:建立一种可用于检测JSRV囊膜蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法。为建立可靠的个体动物实验室OPA诊断方法提供技术支持。研究方法:1.通过生物信息分析JSRV囊膜蛋白（envelope protein,Env）。利用DNAStar软件与网络服务器SOPMA、PSIPRED和Predictprotein分别预测JSRV-NM囊膜蛋白的二级结构;通过Protean软件分析其疏水性,表面可能性,柔性区域和细胞抗原指数;并利用网络服务器Bcepred,IEDB和ABCpred预测囊膜蛋白的B细胞抗原表位。结合内源性JSRV（enJSRV）、外源性JSRV（ex JSRV）和地方性鼻内肿瘤病毒（enzootic nasal tumor virus,ENTV）囊膜蛋白氨基酸序列的比对分析结果,筛选出抗原优势表位富集区域和位于ex JSRV与enJSRV囊膜蛋白高可变区VR3内的表位优势区域。2.利用原核表达系统对JSRV囊膜蛋白表位富集区域和位于exJSRV与enJSRV囊膜蛋白高可变区VR3内的表位优势区域进行原核表达并纯化。3.利用纯化的JSRV Env和JSRV Env51-394制备鼠抗JSRV Env多克隆抗体和兔抗JSRV Env51-394多克隆抗体。通过Western blot和免疫组织化学实验检测制备的多克隆抗体的特异性。4.利用合成多肽JSRV CT制备鼠抗JSRV胞质尾区（JSRV CT）的单克隆抗体,通过Western blot和免疫组织化学实验检测制备的单克隆抗体的特异性。5.利用制备的兔抗JSRV Env51-394多克隆抗体和鼠抗JSRV CT单克隆抗体分别做捕获抗体和检测抗体,建立通过羊外周血白细胞检测绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白的双抗体夹心ELISA方法并进行初步应用。研究结果:1.预测了JSRV囊膜蛋白优势抗原表位:第5467、90109、118165、179194、201215、236250、273284、295310、309332、335356、363381、461476、540546、572596和600615位氨基酸。2.原核表达并纯化了JSRV囊膜蛋白和囊膜蛋白第51-394位氨基酸片段。成功制备了鼠抗JSRV Env多克隆抗体和兔抗JSRV Env51-394多克隆抗体,Western blot和免疫组织化学实验显示这两种多克隆抗体不仅可特异性的识别变性条件下完整的囊膜蛋白,还与完整天然的囊膜蛋白发生特异性的免疫反应,结果表明,制备的抗体可用于检测完整囊膜蛋白,作为双抗体夹心ELISA的捕获抗体,能更好的捕获JSRV的囊膜蛋白。3.成功制备了鼠抗JSRV CT单克隆抗体,Western blot和免疫组织化学实验显示该单克隆抗体对变性与非变性的JSRV囊膜抗原均可识别。用制备的鼠抗JSRV CT单克隆抗体,对羊外周血白细胞进行Western blot检测,通过免疫组织化学实验验证Western blot的阳性羊的肺组织,证实鼠抗JSRV CT单克隆抗体检测到2例OPA病例,证明该单克隆抗体具有较好的特异性和应用性。该抗体可作为JSRV的检测试剂,有利于OPA检测方法的建立。4.成功建立了通过羊外周血白细胞检测JSRV囊膜蛋白的双抗体夹心ELISA方法,该方法对羊常见疫病（羊布鲁菌病,羊快疫,羔羊痢疾,羊肠毒血症,羊猝狙,羊痘,小反刍兽疫,口蹄疫）疫苗,羊肺炎支原体,ENTV以及enJSRV的检测结果均为阴性;对JSRV病肺组织提取蛋白的最低检出浓度为0.034 mg/mL;该方法的批间重复性在3.112%6.801%之间,批内重复性在1.380%4.763%之间;包被板在37℃存放7 d后,对阳性样品ELISA检测结果仍为阳性,包被板37℃存放0 d与1、2、3 d比较,阳性样品ELISA检测结果差异均不显著（P>0.05）。实验结果表明建立的JSRV囊膜蛋白双抗体夹心ELISA检测方法特异性、灵敏性、重复性、稳定性较好,在临床活体JSRV感染的检测中有一定的应用价值。结论:本实验预测了JSRV囊膜蛋白表位优势区,表达纯化了JSRV囊膜蛋白和囊膜蛋白抗原表位相对富集区域的第51-394位氨基酸截短囊膜蛋白,基于制备的抗JSRV Env51-394多克隆抗体与抗JSRV CT单克隆抗体建立了检测JSRV囊膜蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法。