幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌及胃MALT瘤的发生发展有密切关系，发展中国家60-80％的人群有Hp感染。VacA(vacuolating cytotoxin)是Hp分泌的一种毒素，于体外可导致哺乳动物真核细胞产生空泡变性，在Hp的致病过程中起重要作用，但其空泡毒性作用的确切机理尚不清楚。开展VacA的研究工作需要大量的VacA抗原，Hp的浓缩上清虽具有明显的空泡活性，但因其蛋白成分复杂而不能完全取代高纯度的VacA用于研究。因此，本研究的目的是通过对多种Hp液体培养方法及液相层析方法的筛选，建立一种简便、可行、可靠的VacA纯化流程，从而使该抗原的大量制备成为可能，为进一步研究VacA毒素的致病机理，包括VacA受体的研究提供物质基础。同时评价中性红摄入法(NRU)检测细胞空泡毒性的应用价值，为研究VacA的作用机制提供可靠的技术方法。在上述基础上，采用蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)及蛋白酪氨酸激酶(PTK)的抑制剂，观察其对VacA空泡毒性的影响，探讨VacA对胃粘膜上皮细胞信号转导通路的作用及VacA受体的特性，并为临床治疗有毒Hp菌株感染提供新的思路。1．幽门螺杆菌液体培养上清中VacA毒素的粗提： 选择两种不同的布氏肉汤成分TSB及MHB，加入不同的支持剂小牛血清(FBS)及CD，组成4组液体培养基TSB＋FBS，TSB＋CD，MHB＋FBS及MHB＋CD。刮取HpCCUG17874菌落至液体培养基中，于37℃微需氧环境150rpm振荡培养72h，于培养前后分别检测细菌浊度。结果显示TSB＋CD组3天后细菌密度达10.33±1.76×10~8CFU／ml，低于TSB+FBS组(13.17±1.15)，但差异不显著。二者培养前后的浊度比及菌体湿重均显著高于以MHB为培养基组第二军医大学 博士学位论文 中文初要 冲叼．of）。ii培养基组内加入不同支持物（CD或FBS）时，Hp扩增效果相差不显著0列．05）。通过50％饱和度的硫鞭沉淀4组培养液上清中的蛋白，并经 10mmol几 PB缓冲液透析及滤膜离心后制成 Hp上清浓缩液。LOWry七法测得 250pl浓缩上清内蛋白含量，TSB＋CD组蛋白浓度平均为 2．4410．39 m令ml，显著高于 ii＋CD组 （0．52 10．19mg／ffil，P＜0．of人含 FBS组蛋白浓度较高。各组样品SDS－PAGE电泳结果显示含HB组Hp上清浓缩液中均可见清晰的95kDa条带（VacA），但其中以 FBS为支持物组蛋白条带数量多，尤以 66ica条带明显。PX CD为支持物组可见 10余条带，大部分位于 66ma kX T。kX ii为培养基组均来见 95ica的靶片段，且蛋白条带较TSB组明显减少。 将各组样品经倍比稀释后与胃癌SGC刁9＊细胞共同孵育24h，空泡活性观察结果显示空泡均位于核周胞浆内，大小不均，布满整个胞浆。TSB－CD组及HB＋FBS组样品产生空泡明显，于 1：5滴度空泡形成细胞均达 100％，空泡比例随毒素滴度递减，而以 ii为培养基组浓缩上清液无明显空泡活性。NRU于550urn检测光吸收值（A。，。），TSB＋FBS组各滴度（1：5－l：40）及 TSB＋CD组各酒度门：5～1：ZO）均产生明显的空泡活性。两组均以1：5滴度时山扣最高，TSB＋FBS组为 0．68t0．07，高于％B＋CD组（0．5410．09），但差异不显著（P＞0．05）。且两组均随毒素滴度的降低呈现明显的递减趋势。结果表明，TSB＋CD培养基液体培养的效果较好，可以代替含血清培养基用于Va。A蛋白的分离纯化。 采用TSB＋CD组浓缩上清，观察孵育时间长短对空泡毒性的影响，结果表明空泡活性具有明显的时间依赖性。当毒素滴度为1：2时，孵育 4h即产生明显空泡（A”。＝0．43L0刀6），至 16h达最高吸收值（A”。＝0．71 10．03），至 24h时因细胞大量死亡，A。。。反而下降。l：5毒素滴度的时间曲线较1：2滴度更恰当反应出空泡活性随孵育时间变化的特 －2－第二军医大学 博士学位论文 中文摘要性。NRU对空泡的判断与细胞计数法基本符合，且 1：40滴度组空泡细胞比例为 0．8土0．3％（－＊但 NRU检测结果显示 A55。＝0＊ 2土0＊4，与空白对照相比仍有显著差异（P＜0刀5）。结果表明，NRU较细胞计数法有更高的敏感性，且有助于空泡活性的定量评价。2．Va“毒素的纯化： 地浓缩上清进一步采用吸附层析、疏水层析、阴离子交换层析及撇过滤方法进行 VacA蛋白的纯化。由几 培养液中提取的蛋白透析样品 sml上样于羟基磷灰石柱，流速 0．35 mlimin，分 lmlj管收集，经 10。Oil PB洗脱出现A、B两峰，A峰最高吸收值达278llLAU，B峰最高达 252帆U。再以 10。OI／L－400。Oil PB不连续梯度洗脱时出现 C峰，吸收值为 15haU。经 N’RU检测空泡活力存在于 A峰。共收集A峰样本约sml，予以 50％饱和度的硫鞭沉淀蛋白，经 60nunol／L Tis（pH7．7）缓冲液透析。再上样于PhellylsepharoseCL＊B疏水层析柱，用含0．5 mol几则几迢O。的 60nunol／L Tis洗脱，出现 A峰，最高吸收值 124haU，继续予以 60mOI／L TriS洗脱出 B