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研究目的 建立T淋巴细胞免疫功能重建模型,提供进行免疫与肝癌转移关系研究的实验平台。应用该模型研究T细胞免疫功能重建对小鼠高、低淋巴结转移潜能的肝癌的影响,同时研究影响肝癌转移的免疫学因素,为深入寻找肝癌生成、转移的免疫学机制提供新的思路,寻找免疫干预肝癌转移的方法。 进一步研究经负载不同转移潜能肝癌抗原的树突状细胞(DC)诱导的激活T细胞免疫功能重建对小鼠高、低淋巴结转移潜能的肝癌的影响,同时进一步研究影响肝癌转移的免疫学因素,为肝癌生成、转移的免疫学机制。 探讨小鼠淋巴道高、低转移潜能的肝癌细胞在体内淋巴道转移状况和淋巴管生成对淋巴道转移的影响并分析原因。 研究方法 分离Balb/c小鼠的T淋巴细胞,尾静脉注射入接种高、低转移潜能小鼠肝癌细胞株的Balb/c nu/nu裸鼠体内,每周重复注射一次,建立免疫功能重建模型。通过检测实验裸鼠体内的淋巴细胞比例和淋巴细胞功能评定模型的效果。 对T细胞免疫功能重建后的裸鼠足垫接种淋巴道高、低转移潜能细胞株,观察足垫接种小鼠不同转移潜能肿瘤的生长速度,转移程度。进一步应用DNA微阵列技术对免疫重建后的裸鼠体内的淋巴细胞进行免疫相关基因的检测。应用流式细胞仪对不同转移潜能的肿瘤细胞表面的MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ进行检测。应用半定量RT-PCR对肿瘤细胞分泌的免疫抑制相关因子IL-10、TGFα、TGFβ的程度进行进一步检测,寻找影响肝癌转移的免疫学原因。 应用激活的T淋巴细胞进行免疫功能重建。采用Balb/c小鼠的骨髓干细胞在IL-4与GM-CSF诱导下分化成DC,再负载淋巴道高、低转移潜能的小鼠肝癌抗原,诱导Balb/c小鼠T淋巴细胞,对Balb/c nu/nu小鼠进行免疫重建,观察足垫接种小鼠不同转移潜能肿瘤的生长速度,转移程度。应用双向混合淋巴细胞反应体外检测免疫重建的效果。用淋巴细胞增值实验检测肿瘤细胞对淋巴细胞的免疫抑制作用。采用ELISA法检测免疫重建前后裸鼠体内免疫抑制相关因子IL-10、TGF以及血管/淋巴管生成相关因因子VEGF的变化。应用Tunel检测方法对免疫重建组及未重建组的小鼠肿瘤凋亡进行进一步的检测。应用四步离心法分离高低转移潜能肝癌细胞株的Exosomes,进行电镜检测,并应用