研究背景毛囊是人体最为复杂的微小器官之一,其最主要的功能就是生长毛发。毛发对身体主要有人体防护、保温、掩饰、分泌汗液和皮脂、感觉和传导信息的作用,其中,最主要的作用是增加信息交流及传递美感。秃发及多毛症目前是个世界性的难题,根据一项统计,全世界大约50%的成年人均要面对雄激素源性脱发这个棘手问题。尽管毛发疾病一般不威胁人体生命,但是其对人们的心理冲击却是难以估量的。由于对毛囊发生、发育和生长周期的调控机制尚不完全清楚,迄今为止,医学界对上述疾患仍无十分有效的治疗方法。因此,了解毛发的发育及再生机制、实现毛发的高效再生是近年来的一件迫在眉睫的难题。许多资料显示：胚胎毛囊发育的形态发生与成人毛囊再生的过程非常相似,参与胚胎毛囊发育的许多信号因子在成人毛囊再生时同样强烈表达,促进成人毛囊干细胞向毛囊上皮细胞分化的信号很可能与诱导胚胎毛囊形态发生的信号相一致。因此,对毛囊发生、发育信号通路的研究,尤其是了解这些信号对于毛囊形态发生启动的调节机制,有助于更加详细地阐明毛囊再生的分子机制,从而开发促进或抑制毛发生长的相关药物,使得更快更早更有效地治疗脱发等毛发相关疾患成为可能。在胚胎发育期间,毛囊的形态发生依赖于真皮和表皮间一系列信号的调控,它们介导了两个细胞群体之间的相互作用,诱导两个细胞群体有序增殖和分化,引导细胞最终形成毛干、根鞘和毛乳头。这些信号包括Wnt/Wingless家族、成纤维细胞生长因子家族（FGFs）、骨形成蛋白家族（BMPs）、外胚叶发育不全基因（Eda/Edar）、转化生长因子β2 （TGF-β2）、Sonic Hedgehog（Shh）等。其中,许多基因敲除和转基因的动物模型提示Wnt信号是促进毛囊发育的关键因子Wnt家族蛋白与果蝇Wingless蛋白同源,是一类脂质修饰的分泌型糖蛋白家族。Wnt信号通路可分为3个分支：Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）通路、Wnt/平面细胞通路、Wnt/Ca2+通路。其中,Wnt/β-catenin通路通过调控细胞浆中β-catenin的水平浓度而发挥作用,当Wnt信号不存在时,细胞浆中的β-catenin很快就被降解；当Wnt信号存在时,Wnt信号抑制β-catenin被降解,在细胞浆中积聚并部分转移到胞核,启动相关基因的表达。Wnt信号决定了未分化表皮细胞的命运。在转基因小鼠中,当表皮细胞被强行表达Wnt信号的抑制剂Dkk1或者表皮细胞缺少β-catenin时,所有的毛囊缺失；相反,当表皮细胞被强行表达β-catenin时,毛囊发育异常增多。然而,人和小鼠的Wnt家族成员有19种之多,究竟是哪一种或者几种-Wnt蛋白在毛囊形成中有效发挥以及如何发挥其作用仍未明了。对在小鼠身上有表达的所有Wnt成员进行全面检测分析,包括小鼠胚胎皮肤和出生后的皮肤在内,只有Wnt10b、Wnt10a、Wnt5a在毛囊的发育早期特异表达,其中,Wnt10b在胚胎皮肤毛囊发育启动和成年毛囊再生启动时表达尤其明显。不仅如此,一些实验提示外源性Wnt10b蛋白能够促进体外培养的小鼠胚胎皮肤毛囊的发育,在Wnt3、Wnt5a、Wnt11和Wnt10b这几个Wnt成员当中,只有Wnt10b具有诱导未成熟表皮细胞向毛干及内根鞘细胞分化,和刺激体外培养的毛囊毛干生长的能力。据此,我们推测：Wnt10b极有可能促使β-catenin在表皮和（或）真皮细胞胞浆积聚并核转移,启动相关基因的表达,继而诱导毛囊的发育,对其功能的进一步研究,将有助于开发针对毛发疾病的新疗法为了进一步阐明Wnt10b在毛囊发育过程中的具体作用,我们首先观察Wnt10b/β-catenin在大鼠胚胎皮肤毛囊形态发生过程中的动态表达；同时,体外构建适合研究毛囊发育启动的胎鼠皮肤培养模型,该模型不仅毛囊短期发育与体内一致,而且培养条件稳定、便于实验干预；然后利用基因工程技术构建重组Wnt10b蛋白,接着将重组Wnt10b蛋白和RNA干扰技术与培养模型结合,分别模拟基因调控技术中的功能获得性突变和功能缺失性突变,探讨胎鼠皮肤Wnt10b蛋白的表达强弱与毛囊发育启动中基板形成及其分布的关系。第一章大鼠胚胎皮肤毛囊形态发生与Wnt10b/β-catenin的表达目的观察SD大鼠胚胎背部皮肤毛囊的形态发生和Wnt10b/β-catenin信号在毛囊发育过程中的表达。方法取胎龄13-20d的SD大鼠胚胎及1-3d新生鼠的背部皮肤,采用石蜡包埋、切片、HE染色,对SD大鼠胚胎皮肤毛囊的发生过程及其形态学特征进行描述,同时应用荧光免疫组化染色,观察Wnt10b及β-catenin在毛囊发育过程中的时空表达。结果胎龄第13d,SD大鼠胚胎外层由一层周皮组成,皮肤与皮下组织尚未分化；胎龄14～15d的胎鼠背部皮肤肤逐渐由单层向多层转化,毛囊最早的形态发生时间大约为胎龄第15d后期、16d早期（15.5～16d）；大鼠出生后第3d,最早启动形态发生的毛囊发育基本完成；毛囊基板形成之前,Wnt10b及β-catenin均匀表达于表皮；当毛囊基板形成后,Wnt10b及β-catenin仅仅强表达于基板；随着毛囊继续发育,Wnt10b及β-catenin的表达局限于紧贴“真皮浓缩”的毛囊上皮及毛基质细胞；毛囊之间的表皮细胞和毛乳头细胞未见明显表达：在毛囊发育启动早期,免疫组化提示毛囊基板细胞核出现β-catenin阳性表达。结论SD大鼠背部皮肤最早期的毛囊发育启动于胎龄15.5-16d,基本结束于出生后第3d; Wnt10b及β-catenin参与启动毛囊的形态发生和毛囊的进一步发育。第二章大鼠毛囊发育启动阶段模型构建及其WntlOb/β-catenin信号表达的观察目的构建适合研究毛囊发育启动的胎鼠皮肤体外器官培养模型,观察Wnt10b/β-catenin信号在该模型毛囊发育过程中的时空表达。方法将胎龄14d-17d的胎鼠背部皮肤以明胶海绵为载体,在DMEM培养液的气液交界平面中漂浮培养3-6d,石蜡包埋、切片、HE染色,观察毛囊发育并与体内毛囊发育横向比较；免疫荧光法动态观察Wnt10b及β-catenin在该模型毛囊发育过程中的时空表达；将胎龄15d的胎鼠背部皮肤在含不同胎牛血清浓度的DMEM中培养,3d后取出皮肤组织、石蜡包埋、切片、HE染色,镜下观察各组毛囊数量并做统计学处理。结果在胎龄14d～17d的SD大鼠当中,14d后期至15d早期（14.5～15.5d）的胎鼠背部皮肤体外培养毛囊发育效果最好,体外培养3d以内,毛囊的发育过程保持与体内一致,培养3d后毛囊发育逐渐减慢,直至停止于第四阶段；胎牛血清对毛囊的发育没有明显促进作用（F=1.218,P=0.304）；在培养的前3d, Wnt10b/β-catenin的表达与体内一致,随着培养天数的增加,Wnt10b/β-catenin的表达逐渐减弱,在培养的第6d,毛囊的形态发生停止时,Wnt10b/β-catenin的表达也消失。结论在体外短期培养的胎鼠背部皮肤毛囊发育及Wnt10b/β-catenin信号的表达与体内基本一致,可以作为研究毛囊发育启动的模型；Wnt10b/β-catenin信号的表达与毛囊的发育密切相关。第三章Wnt10b蛋白促进大鼠胚胎皮肤毛囊发育及其机制的初步探讨第一节人Wnt10b基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达目的利用基因工程技术获得人Wnt10b基因真核表达载体,将其转染COS-7细胞并检测其在COS-7细胞中的表达。方法以pUC19-Wnt10b为模板,设计引物并进行PCR扩增出1170 bp的人Wnt10b基因的cDNA编码区序列,然后将PCR产物纯化、纯化后的PCR产物和pEGFP-N1载体分别用EcoR I和KpnⅠ进行酶切,再次纯化以上两种酶切产物并回收,用T4DNA连接酶将两种纯化后的酶切产物进行连接,连接产物转化大肠杆菌DH5a,经过菌落PCR,酶切鉴定后送去英骏公司测序鉴定；用脂质体LipofectamineTM2000将鉴定正确的载体转染入COS-7细胞中,用Western blot和免疫细胞化学方法检测COS-7细胞Wnt10b蛋白表达情况。结果人Wnt10b基因cDNA正确克隆到真核表达载体pEGFP-N1载体中,成功构建了pEGFP-N1-Wnt10b真核表达载体；将pEGFP-N1-Wnt10b体外转染COS-7细胞,Western blot和免疫细胞化学方法检测可见转染后的COS-7细胞Wnt10b蛋白表达明显增高。结论本研究成功构建了包含人Wnt10b基因的pEGFP-N1-Wnt10b真核表达载体；将pEGFP-N1-Wnt10b转染COS-7细胞,COS-7细胞能够表达重组WntlOb蛋白,这为研究Wnt10b在毛囊发育过程中的作用及其机制提供一个有利的研究工具。第二节重组人Wnt10b蛋白促进大鼠胚胎皮肤毛囊发育的初步探讨目的观察基因工程重组的人Wnt10b蛋白能否促进大鼠胚胎皮肤毛囊的发育和探讨其潜在机制。方法将pEGFP-N1-Wnt10b体外转染COS-7细胞,转染成功后继续用DMEM培养液培养,每天收集培养上清液,制备含有Wnt10b蛋白的DMEM培养液；将胎龄14.5～15d的胎鼠背部皮肤置于含有Wnt10b蛋白的DMEM培养液中培养3d,在培养的第48h取出部分组织用Western blot检测Wnt10b蛋白和β-catenin的含量；在培养的第72h,将皮肤组织取出石蜡包埋、切片,HE染色,镜下观察各组毛囊发育情况并做统计学处理。结果在含Wnt10b蛋白DMEM培养液中培养的胎鼠背部皮肤组织新形成的毛囊数量较对照组增多（F=6.642,P=0.002）,同时该组织表达的Wnt10b蛋白和β-catenin也同样增强。结论当胎鼠背部皮肤在体外培养时,Wnt10b蛋白促进皮肤的毛囊发育,而且,Wnt10b蛋白很可能通过经典的Wnt信号通路调控细胞β-catenin水平来发挥作用的。第四章靶向Wnt10b的siRNA抑制胚胎皮肤毛囊发育的初步研究目的利用RNA干扰技术抑制体外培养的胎鼠皮肤Wnt10b蛋白的表达,观察沉默Wnt10b基因的表达能否抑制毛囊的发育和探讨其潜在机制。方法采用广州锐博生物科技有限公司提供的3条siRNA-Wnt10b正反义链和1条阴性对照的正反义链；按分组将胎龄14.5～15d的胎鼠背部皮肤置于含有siRNA/LipofectamineTM2000复合物的DMEM培养液中培养,24h后更换为含10%FBS的DMEM培养液,继续培养48h。分别在培养的第24h、48h和72h取出部分组织用荧光定量PCR检测皮肤组织Wnt10b和β-catenin的（?）nRNA表达；在培养的第72h,取出部分组织用Western blot检测皮肤组织Wnt10b和β-catenin的蛋白含量。将上述方法筛选出的最佳序列和对照组再次重复上述步骤培养,72h后取出皮肤组织石蜡包埋、切片,HE染色,镜下观察各组毛囊发育情况并做统计学处理。结果siRNA-Wnt 10b转染胎鼠背部皮肤的第24h和第48h,荧光定量PCR提示：与对照组、空白组比较,各个实验组均出现不同程度Wnt10b mRNA下降,各组综合比较发现E组（SiRNA-Wnt10b₀03）效果较好；第72h,与对照组比较,各组Wnt 10b mRNA水平均已回升；在各个时间点β-catenin mRNA实验组与对照组比较没有明显下降,同时也没有随着Wnt10b mRNA水平的起伏而明显波动；在培养的第3d,E组（SiRNA-Wnt10b₀03） Wnt10b蛋白表达减少时,β-catenin的蛋白表达也跟着减少；HE染色观察提示实验组新形成毛囊数量较对照组减少（t=3.254, P=0.002）。结论在体外器官培养的环境中,siRNA能够抑制胎鼠背部皮肤组织Wnt10b蛋白的表达,从而抑制毛囊发育的启动,减少新形成毛囊的数量；siRNA与胎鼠皮肤的体外器官培养结合,可以模拟转基因鼠的基因敲除；Wnt10b与β-catenin的mRNA表达没有直接关系,但可能在蛋白水平上调控细胞β-catenin的表达。全文小结1.在国内外首先动态观察了Wnt10b/β-catenin在SD大鼠胚胎背部皮肤毛囊发育过程中的时空表达；而且,观察到在毛囊发育早期,基板的细胞核出现β-catenin的阳性表达,证实Wnt10b/β-catenin信号通路参与SD大鼠毛囊的发育；2.构建了适合研究毛囊发育启动的SD胎鼠皮肤器官培养模型,同时观察Wnt10b/β-catenin信号在该模型毛囊发育过程中的时空表达；3.利用基因工程技术构建了包含人Wnt10b基因的pEGFP-N1-Wnt10b直核表达载体；4.在国内外首先将RNA干扰技术和皮肤器官培养模型结合,模拟转基因鼠的基因敲除获得初步成功,为毛囊器官的相关研究提供新的思路与方法；5.分别将基因工程重组的Wnt10b蛋白和RNA干扰技术与体外培养模型结合,模拟基因调控技术中的功能获得性突变和功能缺失性突变,初步证实了Wnt10b蛋白是调控毛囊发育的关键因子,为临床开发相关药物治疗各种毛发疾病提供重要的实验依据。