论文部分内容阅读
甘薯是世界上重要的粮食、饲料和工业原料用作物，是全球种植的主要作物之一。我国甘薯常年种植面积超过9000万亩，占世界甘薯栽培面积的85％以上，年产量超过1亿吨，居世界首位。面对全球能源危机和粮食危机，甘薯在发展生物质能源和作为主要粮食重要补充中扮演着十分重要的角色，是我国首选的生物质能源作物和主要粮食补充作物。
甘薯块根可溶性糖含量，是重要的品质性状之一，其含量的高低和变化很大程度上决定了甘薯的食品品质、加工品质以及抗逆性。蔗糖是植物可溶性糖中含量最高的一种重要的糖类，只有转化为已糖或磷酸已糖后才能进入细胞内参与其他代谢。而上述这一转化过程是通过一系列的酶促反应来实现的。蔗糖合成酶(Sucrose synthase，SuSy)裂解蔗糖，是蔗糖转化为已糖或磷酸已糖这一过程中的关键酶。植物中尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(Uridinediphosphate—gluicose Pyrophophorylase，UGP)催化淀粉糖化过程第一步反应并合成UDPG，处于蔗糖和淀粉途径的交叉点，为淀粉、蔗糖和其他结构多糖直接或间接地提供前体物质。因此，研究糖代谢途径中上述两种关键酶基因有着重要的意义。
本文在研究9个甘薯专用型品种在5个生长时期中块根可溶性糖含量的变化的基础上，以含有甘薯近缘植物(Ipomoea trifida)1/8血缘的甘薯新品种“渝苏303”为材料，对糖代谢途径关键酶基因蔗糖合成酶(IbSuSy)基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(IbUGP)基因进行克隆及生物信息学分析。其结果如下：
一、甘薯生长期间块根可溶性糖含量的变化
通过对9个甘薯品种、5个生长期的双因素试验，甘薯品种块根可溶性糖含量的品种效应、生长期效应和品种×生长期互作效应均达到极显著。品种间块根可溶性糖含景以“渝薯34”最高，为128.92(mg/g，DM)，除与“南薯88”的差异不显著外，与其他7个供试品种的差异均达极显著；“南薯88”次之，为119.05(mg/g，DM)，显著高于“渝苏162”、“渝苏303”和“徐薯22”，极显著高于“渝薯153”、“西农薯2号”、“渝薯123”和“徐薯18”。生长期之间比较，其平均块根可溶性糖含量以栽插后50 d最高，为162.29(mg/g，DM)，极显著高于85 d、108 d、136 d和165 d；栽插后85 d次之，除与栽插后165 d差异不显著外，与栽插后108 d、136 d的差异均达到显著水平。品种×生长期互作效应极显著，说明甘薯品种块根可溶性糖含量在生长期之间的变化因品种不同而极显著不同。
二、IbSuSy和IbUGP的克隆与生物信息学分析
1、根据已报道的植物SuSy保守序列设计引物，以提取的甘薯植株总RNA反转录获得的cDNA为模板，扩增获得长度为707 bp的核心片段，BLASTn分析表明该片段具有SuSy序列特征；根据IbSuSy核心片段设计RACE巢式引物，扩增获得IbSuSy长度为1055 bp的5’末端和1185 bp的3’末端；根据拼接的电子全长设计引物，扩增得IbSuSy物理全长为2698 bp。
2、通过对IbSuSy的生物信息学分析表明：该基因编码长度为727个氨基酸(aa)残基的SuSy蛋白(IbSuSy)，分子量(Mw)为83.26 kDa，等电点(pI)为5.63；甘薯IbSuSy序列与马铃薯SuSy的相似性最高，达到91％；亚细胞定位预测等预测表明该蛋白定位于线粒体，为非跨膜的亲水性蛋白。IbSuSy二级结构预测表明其含有42.09％的α—螺旋、39.20％的随机卷曲和18.71％的延伸主链；功能结构域分析显示该酶存在两个典型的功能结构域，即7-554氨基酸组成的N—端区段(Sucrose—Synth)和565-727氨基酸残基的C—端区段(Glycose—transf-1)，分别行使蔗糖合成和糖基转移的功能。
3、根据已报道的植物UGP保守序列设计引物，以提取的总RNA反转录获得的cDNA为模板，扩增得到502 bp的核心片段，BLASTn分析表明该片段具有典型的UGP蛋白序列特征；根据此核心片段设计RACE巢式引物，扩增获得长度为543 bp的5’末端和长度为976bp的3’末端；根据拼接的IbUGP电子全长设计引物，扩增获得物理全长，长度为1736 bp。
4、通过对IbUGP的生物信息学分析推导该基因编码470个aa残基组成的UGP蛋白(IbUGP)，Mw为51.40 kDa，pI为5.65；IbUGP序列与马铃薯UGP的相似性高达91％，与甘蔗的UGP相似性达87％；通过亚细胞定位预测排除了定位于线粒体、质体、跨膜的可能性，预测能定位于胞液。二级结构预测IbUGP包含47.45％的随机卷曲、33.40％的α—螺旋和19.15％的延伸主链；三维结构建模表明该蛋白具有典型UGP蛋白的四个结构域，分别为中心结构域、C端结构域、N端结构域和糖结构域；活性位点氨基酸残基包括：Lys263、Lys329、Lys367、Lys409、Lys410。
5、通过以甘薯栽插后90 d、120 d、150 d和收获于150 d并于4℃贮藏2周的块根为材料，采用半定量RT—PCR(One Step RT—PCR)的方法对IbUGP基因的表达进行时间和组织表达分析。结果显示，该基因在栽插后120 d表达量最高，栽插后150 d时表达量次之，而在栽插后90 d和4℃贮藏2周的块根中几乎检测不到；在栽插后150 d同一植株不同组织中IbUGP均有表达，但在块根中表达量最高，嫩叶和老叶中表达量次之，叶柄和茎中表达量最少。
本研究调查了9个甘薯品种在5个生长期的块根可溶性糖含量变化，为甘薯育种和产业化开发能提供一定的科学依据。同时，首次成功地从甘薯中克隆了淀粉—糖代谢关键酶IbSuSy基因和IbUGP基因的cDNA全长，并进行相关的生物信息学和组织表达谱分析，为进一步研究IbSuSy基因和IbUGP基因在糖代谢过程中的分子作用机理并用于遗传改造获得高产优质新材料奠定基础。