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启动子是一个重要的基因表达顺式调控原件(cis-acting element),它通过控制基因的转录强度进而调节蛋白的表达。在微生物代谢工程中,通过改变启动子强度,调节代谢流量分配,实现目的产物最优积累已成为工业微生物领域较常用的代谢改造策略。随着代谢工程及合成生物学的发展,对启动子为代表的代谢调控元件进行标准化、模块化处理已成为发展趋势,因此对启动子强度表征方法的准确性和效率提出了更高的要求。由于目前常用的基于报告基因表达量的表征方法操作步骤繁琐,受到其他调控元件的干扰以及细胞生理状态的影响,效率较低,准确性差,不同表达体系之间无法进行直接比较,因此亟待建立一种新型的、直接的、高效的启动子定量分析方法。本文首先以噬菌体T7转录系统为模式研究对象,对T7启动子与T7 RNA聚合酶(RNAp)交互作用开展基于原子力显微镜(Atomic Force Microscope,AFM)力谱(force spectroscopy)分析的分子交互作用研究,建立了启动子与RNAp体外交互作用分析平台,并通过体内报告基因的表达量等分析,验证体外交互作用分析启动子强度的有效性。基于此平台,以大肠杆菌的启动子为研究对象,通过定点改造,得到在启动子核心区域关键位点存在突变的一系列启动子,分析这些启动子与大肠杆菌RNAp之间的交互作用,初步验证了大肠杆菌启动子序列与活性的关联。本文主要研究成果如下:(1)建立了可用于AFM力谱分析的基底及探针的修饰方法。选择表面平整的硅基底进行化学改性及T7 RNAp固定,通过AFM对基底表面扫描成像,选择了较优的基质烷基化修饰策略,并优化了T7 RNAp硅基底的固定化浓度,由此得到的基质在固定蛋白后,蛋白分布均匀并密度适中,为较优的固定化策略;同时,启动子通过其3’端修饰的巯基与探针金镀层的表面形成Au-s配位键固定于AFM探针表面。通过与多组对照实验,证实该固定化体系降低了表面的非特异性结合概率,提高AFM力谱检测的灵敏度和有效性。(2)建立了基于AFM力谱技术的启动子与RNAp体外交互作用分析方法。通过采集大量AFM力-距离曲线,结合统计学分析,得到了T7启动子与T7 RNAp间的交互作用力为304.2±12.7 pN。对T7启动子的-10及-11位点进行突变,测得突变启动子与T7RNAp间的交互作用力、解离距离及结合概率。通过与对照实验对比,验证通过上述分析得到的交互作用为T7启动子与RNAp之间的特异性结合。利用启动子探针质粒,通过报告基因—氯霉素乙酰转移酶(Chloramphenicol Acetyl transferase,CAT)的酶活表征得到的启动子强度的结果与体外AFM力谱分析一致,初步验证了启动子体外交互作用分析的有效性。(3)基于AFM力谱分析的大肠杆菌启动子筛选。确定了大肠杆菌RNAp基底固定化的最优浓度为100 U·m L-1。基于前部分研究建立的AFM力谱分析启动子强度的方法,选取了大肠杆菌的Ls1强启动子为研究对象,并以它的序列作为原始序列,设计一系列在关键位点(-10区和-35区)有突变的启动子序列。考察了Ls1等启动子与RNAp间的交互作用力,结合概率,筛选了不同强度的启动子。并通过测定CAT酶活验证了上述结果。(4)大肠杆菌启动子序列特征与启动子/RNAp交互作用力间的关联分析。Ls1启动子是在-10及-35区具有保守序列的强启动子,其体外交互作用力为331.1±5.1 pN。通过删除Ls1启动子的-10区定向改造得到Ls2启动子,对其进行体外交互作用分析发现,与Ls1启动子相比,所测得的作用力的概率分布未体现正态分布特征,无特异性交互作用力。在-10区保守序列不变的前提下,对-35区进行突变,得到Ls1-T2(1个碱基差异),Ls1-T1(1个碱基差异)以及Ls1-35(3个碱基差异)三个启动子,测得的体外交互作用力分别为293.3±5.5 pN,271.9±6.7 pN,243.5±5.2 pN。与Ls1启动子比较发现,关键位点越保守交互作用力越大。综上结果,从启动子与RNAp结合力的角度验证了启动子-10区及-35区的保守区域对启动子活性的显著影响。