静原鸡肌肉组织转录组学分析及其肌苷酸相关基因的筛选与鉴定

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本研究在测定静原鸡肌苷酸(inosincacid,inosinemonphosphate,IMP)、肌苷及部分物理指标(剪切力、系水力、蒸煮损失率)的基础上,通过转录组测序(RNA-seq)筛选不同部位与IMP相关的关键差异基因,运用生物信息学方法分析差异基因的结构与功能并通过分子生物学的方法构建其真核表达载体。选取相同饲养管理条件下180日龄静原鸡公、母各15只。采集其腿肌、胸肌并测定剪切力、系水力、蒸煮损失率、IMP和肌苷,并对静原鸡胸肌、腿肌进行转录组学分析,筛选和IMP相关的差异基因进行结构和功能预测分析,主要研究结果如下:(1)IMP、肌苷和蒸煮损失率静原鸡公鸡胸肌显著或极显著高于腿肌(P<0.05或P<0.01);IMP、肌苷和系水力静原鸡母鸡胸肌均极显著高于腿肌(P<0.01),蒸煮损失率腿肌极显著高于胸肌(P<0.01);系水力和剪切力静原鸡母鸡胸肌显著或极显著高于公鸡(P<0.05或P<0.01),腿肌蒸煮损失率母鸡极显著高于公鸡(P<0.01);公鸡胸肌、腿肌的IMP与肌苷均呈显著负相关(P<0.05);母鸡胸肌、腿肌的IMP与肌苷、蒸煮损失和系水力均呈负相关,且腿肌IMP与剪切力呈显著负相关(P<0.05)。(2)转录组测序发现胸肌和腿肌之间的显著差异表达基因总数为2 098个,其中胸肌相对腿肌基因显著上调1 146个,显著下调952个。差异基因共参与3 117个Gene Ontology term,其中881个GO term参与分子功能(Molecular Function,MF),1 836个GO term参与生物学过程(Biological Process,BP),400 个 GO term 参与细胞组分(Cellular Component,CC)。同时所有差异基因共参与75条KEGG通路,根据评价肉质的指标,选出9个与肉质相关的通路,从中筛选出可能与肉质有关的差异基因34个,进一步在IMP合成相关的嘌呤代谢通路中筛选到AK1、PKM2、PGM1等3个可能与IMP相关的差异基因。(3)相对定量试验表明,静原鸡胸肌AK1基因的mRNA表达量极显著高于腿肌(P<0.01);相关性分析发现IMP在静原鸡公鸡胸肌中与AK1基因mRNA表达量呈负相关,相关系数为-0.404,在腿肌中与AK1基因mRNA表达量呈正相关,相关系数为0.271;IMP在母鸡胸肌、腿肌中与AK1基因mRNA表达量均呈显著正相关(P<0.05),相关系数分别为0.534和0.538。(4)静原鸡AK1基因CDS区生物信息学分析发现AK1基因与AMPD1、PKM2、ADSL存在共表达;AK1蛋白含有194个氨基酸,是具有较强亲水区域的非跨膜蛋白;AK1蛋白可能存在苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)和酪氨酸(Tyr)磷酸化位点,分别有8个,7个,3个,并且可能含有10个B细胞抗原表位,两个CpG岛,预测其在细胞质中发挥作用。α-螺旋和无规则卷曲是静原鸡AK1蛋白主要的二级结构和三级结构。(5)成功构建AK1基因的真核表达载体:AK1-pEGFP-N1。以上研究结果为改善静原鸡肌肉风味、地方品种资源开发和利用提供理论基础,为调控IMP相关基因的筛选提供重要依据,同时对后续深入研究AK1基因功能具有理论支撑作用。
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