心脏纤维化是几乎所有心脏疾病进展到终末期共同的病理基础,其进展程度与心脏病人的预后密切相关。心脏纤维化主要是心肌细胞在多种刺激作用下凋亡,这一凋亡产生的信号转导会导致巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等在心脏的蓄积,成纤维细胞的活化和胞外基质的合成与分泌,进而促进心脏纤维化甚至是心衰的进展。目前针对心脏纤维化的治疗尚无获批的药物,针对心脏纤维化发病新机制的寻找和治疗药物的研发显得迫在眉睫。根据国家心血管病中心发布的《中国心血管病报告2018》,我国心血管疾病患病人数为2.9亿,心血管病死亡占城镇居民死亡的43%以上,已远超肿瘤。且在采取了一、二级预防基础上,据测算今后10年我国心血管病患病人数仍将快速上涨,提示心脏血管疾病仍有其他未被发现的重要病因。流行病学调查显示母体暴露于吸烟、营养缺乏或过剩、代谢性疾病或母体牙周炎等异常子宫内环境时,子代心血管病发病几率远高于正常出生的个体。有鉴于此,本研究团队十余年前提出了成年子代个体心血管疾病的发病可能追溯到孕期炎症免疫刺激的科学假说,并证实,孕期炎症暴露可以导致子代血压升高,且在子代观察到了心脏重构的现象,子代p38激活和ROS-p38 MAPK相互作用是心脏损伤敏感性增加的重要机制。这一研究结果深刻扩大了心血管疾病的防治的时间窗,同时针对这一结果的心血管病早期干预将在全球范围内有效减少心血管疾病的发病。但母体的孕期炎症刺激如何影响子代心脏纤维化进展的机制仍亟待阐明。BMP10是一种属于心脏特异的心脏生长因子。本团队的既往研究发现,BMP10是心脏正常发育重要维持者并可以显著的抑制出生后小鼠心脏的生理性肥大,但BMP10在心脏纤维化上的作用仍有待进一步探索。为此,基于课题组前期工作,本研究拟从探索孕期母体炎症暴露如何通过母胎界面传递到胚胎进而影响子代心脏纤维化的机制,以及寻找可能有效的心脏纤维化干预分子两个方面开展研究,旨在为阐明孕期炎症暴露子代心脏纤维化的生命早期机制、寻找新的可能干预靶标,以及新的干预分子提供实验参考、奠定理论基础。方法和结果:1.孕期炎症暴露子代心脏纤维化的机制（1）孕期炎症暴露对4周龄子代小鼠心脏基因表达的影响为明确子代心脏的表型,我们通过转录组测序（RNA-seq）首先检测了孕期炎症刺激子代小鼠和正常出生子代小鼠4周龄时心脏的基因表达情况。而后我们对46个差异基因进行了IPA分析,结果显示有意义的差异改变通路主要富集在Interferon Signaling通路上,而后的差异基因的功能分析主要体现在促进单核细胞移动（cell movement of myeloid cell）、器官炎症（inflammation of organ）、病毒感染（viral infection）和高反应性（hypersensitivity reaction）上。（2）孕期炎症暴露对母胎界面iNKT状态及炎症因子水平的影响我们检测了iNKT在母胎界面的子宫,蜕膜和胎盘上的状态。我们发现在孕期LPS刺激后48小时（子宫）和72小时（蜕膜和胎盘上）观察到iNKT比例增加,其中,在刺激后72小时的蜕膜和胎盘上同时也观察到了显著的活化的iNKT的比例的增加。母体血清的炎症因子IL-6、IL-22以及TNF-α的水平在LPS刺激2小时出现了极为显著的升高,在6小时候后均逐渐回归于正常水平。羊水中IL-22和TNF-α的表达改变与iNKT的活化呈现显著的一致性,在LPS刺激72小时后到达其浓度峰值。母体iNKT激动剂α-半乳糖神经酰胺（α-galactosylceramide,α-Gal/Cer）暴露后,在羊水中也发现了同样表达模式的IL-22和TNF-α的表达改变。（3）孕期炎症暴露对子代心脏巨噬细胞浸润水平的影响相较于正常出生的子代,流式检测发现孕期炎症刺激子代早在孕18.5天就出现了显著的心脏骨髓来源的巨噬细胞浸润增加。ELISA检测发现子代小鼠出生后1,2和4周时心脏MCP-1的表达升高。流式细胞检测发现4周龄子代中,孕期炎症刺激显著增加了子代心脏的单核细胞,巨噬细胞的浸润,但对树突状细胞的比例未产生明显的影响。使用CD1d^-/-♀×C57♂交配的方式来复制孕期炎症刺激模型,在子代4周龄时检测心脏巨噬细胞的浸润发现,母体的NKT敲除可以显著恢复子代心脏免疫系统的状态。使用α-Gal/Cer（3μg/mouse）则会显著的增加子代小鼠4周龄时心脏巨噬细胞的浸润,其程度与孕期LPS刺激相当。（4）孕期炎症暴露对子代小鼠心脏炎症状态的影响孕期炎症刺激子代小鼠在1和2周龄时并未出现明显的炎症小体NLRP3的活化。而在4周龄时,孕期炎症刺激子代小鼠心脏出现了明显的炎症小体NLRP3活化。孕期炎症刺激子代小鼠4周龄心脏显著高表达IL-6,IFN-γ和TNF-α。IL-17A的表达水平在正常出生子代和孕期炎症出生子代上未见明显差异,而IL-10和IL-1β的表达水平在当前实验条件下未被检测到。（5）孕期炎症暴露对子代心脏损伤敏感性的影响对于孕期炎症刺激后的子代小鼠和正常出生子代小鼠,附加了一次异丙肾上腺素（Isoproterenol,ISO,5mg/kg,皮下注射）刺激72小时后,使用表达谱测序检测心脏基因表达改变,HE和Masson染色观察心脏的形态,免疫组化观察心脏免疫细胞浸润情况。相较于正常子代附加ISO刺激（offspring-p Saline+ISO）,孕期炎症刺激子代在附加ISO处理后（offspring-p LPS+ISO）呈现出更显著的胶原沉积,以及纤维化标志物Collagen Ⅲ和α-SMA的高表达,同时免疫组化的结果显示offspring-p LPS+ISO较offspring-p Saline+ISO出现了显著增加的免疫细胞浸润。RNA-seq结果显示offspring-p LPS+ISO与offspring-p Saline+ISO差异基因更多的富集在心脏炎症和胞外基质沉积相关的信号通路上。IPA分析也显示差异基因的活性通路预测也主要体现在增强的心脏炎症和心脏肥大上。（6）母胎界面的iNKT状态对子代心脏损伤敏感性的影响iNKT激动剂α-Gal/Cer模拟孕期炎症刺激的基础上对子代进行类似的ISO再刺激,形态学结果显示孕期使用α-Gal/Cer激活iNKT的条件可以同样产生子代易感于心脏损伤的现象。在母体水平上敲除iNKT细胞可以显著的恢复子代对心脏损伤的敏感性。2.BMP10对心脏纤维化的影响（1）异丙肾上腺素（ISO）对αMHC-Bmp10小鼠心功能的影响为探索始于胚胎期心脏特异的BMP10过表达（αMHC-BMP10）能否抑制心脏的病理性肥大,我们在出生后8周龄BMP转基因小鼠（TG）和对照小鼠（NTG）上使用ISO pump诱导心脏肥大模型（Alzet mini-pumps,1μl/hour,持续7天）。BMP10过表达可以显著抑制ISO长时程暴露导致的心脏纤维化面积、心功能损伤、心脏胶原沉积以及心肌细胞的凋亡。（2）出生后诱导心脏特异过表达BMP10小鼠构建鉴于αMHC-BMP10可以抑制心脏的生理性肥大,为避免这一因素对心脏病理性肥大的影响。我们构建了可诱导的心脏特异的BMP10过表达小鼠:在α-MHC启动子区和编码全长的BMP10的c DNA区之间插入了一个flox标记的带基因编码终止区的e GFP（α-MHC-e GFPf-Bmp10）,这一flox小鼠并不影响心脏形态结构和心脏功能。而后将该小鼠与带有心脏特异的含有可诱导Cre酶（α-MHC-Mer Cre Mer）表达的小鼠交配,得到可诱导心脏特异表达BMP10的小鼠（α-MHC-e GFPf-Bmp10:α-MHC-Mer Cre Mer）。在子代个体8周时,使用他莫昔芬处理,q-PCR结果显示心脏BMP10呈现过表达。（3）条件性诱导过表达BMP10对ISO诱导的心脏损伤的作用为验证BMP的直接干预是否能够改善ISO诱导的心脏损伤,将8周龄的α-MHC-e GFPf-Bmp10:α-MHC-Mer Cre Mer首先使用他莫昔芬诱导BMP10过表达,未处理的作为对照鼠;而后使用ISO长时程暴露诱导心脏损伤。BMP10的心脏诱导过表达可以显著抑制ISO诱导的心脏纤维化、心肌细胞凋亡以及心功能损伤。而后在野生型小鼠上是用ISO暴露诱导心脏损伤同时给与BMP10重组蛋白注射剂干预,我们也同样的发现,BMP10的给与可以显著的减轻心脏纤维化的面积并恢复心脏功能。（4）重组人BMP10蛋白的制备、纯化和功能验证为进一步明确BMP10的心脏保护作用,探索外源性的BMP10对对ISO长时程暴露导致的心脏纤维化的影响。我们首先制备纯化了重组人BMP10,体外验证了重组人BMP10蛋白活性,在体使用了2种不同品系的小鼠复制了ISO诱导的心脏纤维化模型,在给与重组人BMP10蛋白后均观察到了其心脏保护作用。（5）生物信息学分析BMP10过表达小鼠影响的基因网络对BMP10过表达后表达改变的402个差异基因进行基因本体论（gene ontology,GO）分析和通路分析（Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes,KEGG）后发现,TGFβ/BMP通路是受影响最大的通路。而后Qigen公司的IPA（Ingenuity Pathway Analysis）软件对差异基因的上游调控网络进行预测,发现STAT3和TGFβ/BMP通路是受BMP10过表达影响最大的调控网络。提示BMP10-STAT3通路可能也参与了BMP10心脏保护功能的实现。（6）实验验证BMP10过表达对SMAD和STAT3通路的影响为验证生物信息学分析结果,我们对STAT3和SMAD相关蛋白在BMP10过表达和相应的对照小鼠心脏上的表达水平进行检测。与IPA分析结果一致的是,WB和免疫组化结果显示磷酸化STAT3水平在BMP10转基因小鼠心脏上显著高表达。同时,使用重组BMP10蛋白处理P19细胞株发现,BMP10可以直接迅速的促进STAT3的活化。（7）STAT3条件性敲除对BMP10心脏保护作用的影响为了检测BMP10-STAT3的信号转导是否在BMP10的心脏保护功能上起作用。我们构建了心肌细胞STAT3特异敲初小鼠（STAT3 cKO）,而后使用ISO诱导心脏损伤并附加BMP10的干预。在STAT3 cKO小鼠上,BMP10的干预并不能改善ISO诱导的心功能损伤和心肌细胞凋亡,但可以显著的改善心脏纤维化的面积。（8）BMP10对心脏成纤维细胞胶原合成的影响为探索BMP10对心脏胶原沉积的影响,我们分离了成体心脏成纤维细胞（adult cardiac fibroblasts,ACFs）,使用TGFβ1诱导胶原分泌,用BMP10干预。3H-脯氨酸掺入法发现BMP10可以显著抑制TGFβ1诱导的ACF胶原合成。q-PCR也显示BMP10可以显著抑制TGFβ1诱导的I和III型胶原的转录。miRNA芯片显示miR29,miR30,miR1,miR23以及miR199显著高表达,而miR34显著低表达;其中,miR29c表达差异最明显（Fold change>3,p<0.001）。miR29的抑制序列可以显著的恢复BMP10对Col3a1和Col1a1的表达抑制。结论:1.孕期炎症暴露导致的子代心脏局部单核巨噬细胞系统异常和炎症因子蓄积是子代心脏纤维化敏感性增强的重要原因;2.孕期炎症暴露子代心脏局部免疫系统异常的机制与母体炎症诱发的母胎界面iNKT活化及炎症因子释放有关;3.母体iNKT敲除可以显著的恢复孕期炎症暴露导致的子代心脏纤维化易感性的改变,这一结果揭示了心脏纤维化发病的新机制,并提供了心脏纤维化干预的新靶标,为靶向心脏纤维化的制剂研究提供了有益的实验依据;4.成功制备并分离纯化了BMP10重组蛋白;5.BMP10重组蛋白防治心脏纤维化的机制与调控SMAD1/5/8、STAT3通路以及影响心脏成纤维细胞的纤维化相关miRNA水平有关。