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精子发生(spermatogenesis)是一个极其复杂的过程,起源于精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)自我更新和分化,并且受到多种内分泌及旁分泌信号调节。许多研究表明,miRNAs在小鼠睾丸中广泛表达,许多microRNAs在精子发生,特别是SSCs发育中发挥重要作用。本研究的目的是研究miR-322对体外培养的SSCs自我更新和分化的影响及其作用机制。通过qRT-PCR检测miR-322在SSCs,粗线期精母细胞,圆形精细胞和成熟精子中的表达,发现随着SSCs的发育,miR-322的表达量逐渐降低。然后用miR-322过表达慢病毒载体、miR-322干扰慢病毒载体和其各自的对照慢病毒载体分别感染体外培养的SSCs,增殖实验(如CCK8和EdU)表明,miR-322的过表达促进了SSCs的增殖,并上调了干性相关基因的表达,比如Gfrα1,Etv5和Plzf,而miR-322的抑制使SSCs增殖受到抑制,上调与分化相关的标志基因的表达量,比如Stra8,C-kit和Bcl6,并且利用SYCP3免疫检测到联会复合体结构。接下来,为了探究miR-322调控SSCs自我更新和分化的机制,我们采用TargetScan进行靶基因预测,预测发现miR-322可以和Rassf8 3’UTR相结合。qRT-PCR、western blotting和双荧光素等实验证明Rassf8是miR-322的一个靶基因。MiR-322可通过调控Rassf8的表达促进体外培养的SSCs的自我更新。随后,我们构建了Rassf8过表达慢病毒载体、Rassf8干扰慢病毒载体和各自的对照慢病毒载体,并用其感染SSCs。CCK8和EdU实验结果表明Rassf8的过表达会抑制体外培养的SSCs的增殖,而Rassf8被抑制反而促进了SSCs的增殖。最后,我们用WNT/β-catenin通路的激活剂氯化锂处理SSCs,检测这些SSCs中miR-322和Rassf8的表达量,发现miR-322表达量上调而Rassf8表达量下调,然后检测感染了miR-322干扰慢病毒载体或Rassf8干扰慢病毒载体的SSCs中WNT通路的下游基因的表达,发现miR-322下调会导致下游基因表达下调,而Rassf8被抑制会引起下游基因上调,我们还用western blot检测了下游基因的蛋白表达情况,最后检测了各组SSCs细胞周期,发现miR-322的过表达增加S期和G2/M期比例,miR-322被抑制导致SSCs在G0/G1期停滞,这些结果说明miR-322通过WNT/β-catenin信号通路调控SSCs自我更新和分化。总之,我们的实验结果表明,miR-322可通过调控Rassf8表达来调控体外培养的SSCs的自我更新和分化。我们的研究不仅为miRNA调控SSCs自我更新提供了新的机制,也为男性不育的诊断、治疗和预防提供了理论基础。