手性药物中间体的微生物酶法合成研究

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生物催化法因具备催化效率高、立体专一性好、反应条件温和等优势,相比于传统的化学催化工艺具可以更好的适应于环境友好、资源节约等绿色工业的要求。手性化合物(包括手性药物、手性原材料和手性中间体)是目前运用生物催化技术的主要产品,并且在医药、化学品以及食品工业中有着很广泛的应用。生物催化法又包含以纯酶作为催化剂和以细胞作为催化剂两大类别。这其中以细胞作为催化剂的方法是直接将发酵好的细胞离心洗涤后作为催化剂投入反应的一种生物催化方法,因其不需要再添加昂贵的辅助因子帮助辅酶的再生,且不需要繁琐的纯酶提取工艺,使用起来更为方便廉价。本论文着重研究了运用细胞催化的方法合成手性药物中间体。本论文运用全细胞酶法合成了两种高立体选择性的手性药物中间体,即左乙拉西坦酸和(R)-α-苯乙醇。这其中左乙拉西坦酸是合成抗癫痫药物左乙拉西坦的中间体,而(R)-α-苯乙醇也是合成多种药物的必须中间体。在论文的第二章中,研究了左乙拉西坦酸的生物法合成路线。该路线是根据左乙拉西坦的结构特点,自行设计的一条通过从自然界筛选立体专一性催化剂的方法立体选择性水解乙拉西坦单酯(α-乙基-2-氧合-1-乙酰胺吡咯烷乙酸酯)合成左乙拉西坦酸的路线。根据该路线的要求,从多地区采集的土样中最终筛选得到了一株能够高立体选择性水解乙拉西坦单酯即能够产羧酸酯水解酶的菌株,并通过观察该菌株的细胞结构、菌落形态以及生理生化特征,结合16S rDNA测序分析将该菌株命名为鞘胺醇杆菌SIT102。论文的第三章对鞘胺醇杆菌SIT102的发酵条件进行了初步优化。优化后的最适发酵条件为葡萄糖10g/L,蛋白胨20g/L,MgSO40.5g/L,KH2PO30.5g/L,K2HPO30.5g/L,pH7.0,30°C,180rpm培养36h;经优化的发酵条件培养后细胞量从2.41g/L提高到了3.53g/L,同时比酶活力从最初的1.74U/g提高到了3.16U/g。第四章在发酵条件优化的基础上研究了鞘胺醇杆菌SIT102的最适反应条件。经优化的反应条件为底物浓度5mM,细胞10gdcw/L,pH7.5,35°C,180rpm反应20h。最终底物的转化率、产物的ee值及E值可以分别达到48.3%、96.5%和175.7。第五章中,为了提高实验室现有菌株埃切毕赤酵母AS2.625催化苯乙酮所生成(R)-α-苯乙醇的ee值,自行设计了一种提高产物ee值的方法。在该方法中,尝试添加了多种有机助溶剂、表面活性剂及不同种类的环糊精,并发现β-环糊精能够最大程度的提高产物(R)-α-苯乙醇的ee值。同时优化了该反应体系,优化后的反应体系为苯乙酮20mM,β-环糊精30mM,细胞55gdcw/L,pH7.0,30°C反应24h。优化后产物(R)-α-苯乙醇的ee值从80%提高到了97%,且转化率保持在98%。这一方法应用在以其他芳香酮为底物的反应体系中也能够不同程度的提高产物的ee值,具有很好的应用前景。
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