背景和目的阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是最常见的神经系统退行性疾病,影响全球3500万老年人健康。Aβ级联假说被认为是AD的核心病理机制。过去研究表明,Aβ在脑内过度产生和/或清除障碍间的失衡是AD发生的主要机制,且脑内产生Aβ可通过血脑屏障（BBB）进入体循环代谢。我们及同行在前期研究中发现,约有40%-60%脑内产生的Aβ是可以进入外周并被外周系统清除。但目前,外周系统清除Aβ的具体机制尚不清楚。前期研究证明,固有免疫细胞在清除Aβ中发挥重要的作用。其中,小胶质细胞是中枢神经系统中清除脑内Aβ的主要免疫细胞。血液单核细胞作为脑内小胶质细胞的外周对应细胞,被证实在神经保护、神经炎症调控以及Aβ清除功能等方面均较脑内小胶质细胞强。有研究表明,清除或者损坏外周单核吞噬细胞会加重AD小鼠脑内Aβ斑块沉积。以此为据,单核细胞可能在AD的Aβ外周清除中发挥至关重要的作用。近年来全基因组关联分析（GWAS）发现了一系列与AD相关的免疫风险基因突变,这些风险基因突变大多与小胶质细胞和单核细胞的功能及作用相关。以上证据提示外周单核细胞是Aβ外周清除的重要执行者,单核细胞Aβ清除功能障碍很可能参与AD的发生发展。但是,单核细胞Aβ清除功能在衰老和AD中如何变化,单核细胞Aβ清除功能在Aβ外周清除中的贡献大小均不清楚,而增强血液单核细胞的Aβ清除能力是否具有AD干预作用,值得深入研究。基于以上,本研究旨在探索血液单核细胞Aβ摄取功能在衰老和AD中的变化和机制,同时研究单核细胞Aβ摄取功能在Aβ外周清除中作用。根据研究结果进一步探索增强血液单核细胞Aβ摄取功能对AD的干预作用和机制。材料与方法1.分析血液单核细胞Aβ42摄取与血液Aβ水平的相关性本部分实验招募认知功能正常研究对象25例,应用Percoll非连续性密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）,将带FITC荧光标记的Aβ42与单个核细胞进行共同孵育,并应用流式细胞技术及成像流式技术筛选并检测单核细胞亚群(即CD14+CD16-、CD14+CD16+、CD14dimCD16+亚群)的Aβ42摄取功能。同时留取研究对象血浆,通过SIMOA法检测血液的Aβ水平,并应用偏相关分析单核细胞亚群Aβ摄取功能与血液Aβ水平的相关性。2.分析血液单核细胞Aβ42摄取功能随年龄增长的改变我们于大坪医院健康体检中心纳入22-89岁的认知功能正常研究对象104例,应用Percoll非连续性密度梯度离心法提取PBMC,并应用流式细胞技术筛选并检测单核细胞亚群Aβ42摄取功能。同时应用斯皮尔曼相关分析单核细胞亚群Aβ摄取功能与年龄的相关性。此外,为探索单核细胞亚群Aβ摄取功能随年龄增长的变化轨迹,我们应用Fit spline/Lowess（cubic）spline模型将单核细胞总体、经典型和非经典型亚群的摄取功能与年龄进行曲线拟合。3.分析阿尔茨海默病患者血液单核细胞Aβ42摄取功能改变（1）分析AD患者血液单核细胞Aβ42摄取功能改变纳入AD患者（24例）及其年龄与性别匹配认知正常对照（cognitively normal control,CN,25例）,脑卒中患者（10例）及其年龄与性别匹配CN（10例）。AD患者及相应对照入组后给予神经心理学检测,包括简易智能状态检测（Minimum Mental State Examination,MMSE）,日常生活活动能力（Activities of Daily Living,ADL）、临床痴呆分级评定量表（Clinical Dementia Rating,CDR）和蒙特利尔认知评估（Montreal Cognitive Assessment,Mo CA）等。应用Percoll非连续性密度梯度离心法和流式细胞技术检测并比较AD和脑卒中患者与相应对照间单核细胞亚群Aβ42摄取功能。（2）分析AD患者单核细胞Aβ摄取相关受体及Aβ降解酶的表达水平为探索AD患者血液单核细胞Aβ摄取障碍的潜在机制,我们应用免疫磁珠技术筛选出CD14阳性的单核细胞,并采用流式细胞技术检测主要参与单核细胞介导Aβ胞内摄取的相关表面受体表达变化。同时,应用免疫印迹法检测参与Aβ胞内降解的主要溶酶体酶的表达变化。4.增强单核细胞Aβ代谢功能对AD的干预作用和机制研究（1）云芝多糖对人源单核细胞Aβ代谢功能的影响我们的前期研究结果表明AD患者介导单核细胞Aβ识别的表面受体TLR2表达降低,提示AD患者单核细胞Aβ摄取功能障碍可能与TLR2表达降低有关。故本部分实验应用新型TLR2受体激动剂云芝多糖与单核细胞共同孵育,应用免疫磁珠分离法、流式细胞技术检测云芝多糖对单核细胞对Aβ42摄取功能及该过程相关表面受体表达的影响。同时,应用荧光共聚焦、酶联免疫吸附法及免疫印迹法检测云芝多糖对单核细胞对Aβ胞内提呈和降解的影响。（2）云芝多糖对APP/PS1小鼠认知功能的影响将APP/PS1雌性转基因小鼠被随机分配至两组,分别为云芝多糖预防组和PBS对照组。从小鼠3月龄开始给予云芝多糖腹腔注射（n=8）,注射剂量PSK为2mg/只（相当于100mg/kg）,3次/周,持续6个月。性别年龄匹配的APP/PS1小鼠作为空白对照组（n=8）和性别年龄匹配同窝小鼠作为野生型对照组（n=8）,均腹腔注射等体积的生理盐水,3次/周,持续6个月。既定终点后,三组小鼠均进行Y迷宫、矿场和莫里斯水迷宫等行为学测试。（3）云芝多糖对APP/PS1小鼠脑内Aβ水平的影响应用流式细胞和成像流式技术检测云芝多糖对小鼠血液单核细胞亚群比例及Aβ摄取功能的影响。对药物处理至9月龄小鼠进行取材。将小鼠大脑右半球进行固定和脱水后切片,用液氮冻存小鼠左半球用于生化分析。通过免疫组织化学染色和ELISA检测AD小鼠脑内及血液的Aβ负荷。（4）云芝多糖对APP/PS1小鼠AD相关病理的影响将小鼠大脑右半球进行固定和脱水后切片,用液氮冻存小鼠左半球用于生化分析。免疫组织化学,免疫荧光染色和ELISA方法分别应用于AD小鼠脑内神经炎症、神经元凋亡和Tau蛋白过度磷酸化等指标检测。结果1.血液单核细胞Aβ42摄取与血液Aβ水平的相关性本研究发现单核细胞三个亚群均具有Aβ42摄取功能。其中,中间型亚群CD14+CD16+的Aβ42摄取功能明显高于其它两个亚群。进一步检测单核细胞Aβ42摄取功能与血液Aβ水平相关性,发现单核细胞总体及CD14+CD16-和CD14dimCD16+亚群的Aβ42摄取功能与血液Aβ42水平呈负相关。此外,单核细胞总体及CD14+CD16-和CD14+CD16+亚群的Aβ42摄取功能与血液Aβ40呈负相关。2.血液单核细胞Aβ42摄取功能随年龄增长的改变为检测血液单核细胞Aβ42摄取功能随年龄增长的改变,我们于大坪医院健康体检中心纳入104例22-89岁的认知功能正常研究对象,且不同年龄段（20-45岁、46-65岁、>65岁）间性别比例无统计学差异。我们发现,血液单核细胞总体的Aβ42摄取功能随年龄增长而降低。其中,除CD14+CD16+亚群外,单核细胞CD14+CD16-亚群和CD14dimCD16+亚群的Aβ42摄取功能随年龄增长而下降。在应用Fit spline/Lowess（cubic）spline模型将单核细胞总体、经典型和非经典型亚群的摄取功能与年龄进行曲线拟合后发现,单核细胞总体、CD14+CD16-亚群Aβ42摄取功能在20-40岁阶段下降速度较快,40岁之后下降速度相对较缓。而CD14dimCD16+亚群Aβ42摄取功能在40-60岁阶段下降速度较快,60岁之后下降速度相对较缓。该结果提示,不同单核细胞亚群对Aβ42摄取功能随年龄增长的变化趋势并不相同,且该变化可能早于脑内Aβ病理改变。3.阿尔茨海默病患者血液单核细胞Aβ42摄取功能改变为探究单核细胞Aβ42摄取功能在AD中的改变及其特异性,我们招募24例AD患者、10例脑卒中患者以及其相应性别、年龄相匹配的认知功能正常对照者各25例和10例,并检测其单核细胞Aβ42摄取功能。AD、脑卒中患者在教育年限、APOEε4基因型、高血压、糖尿病、高血脂及相应用药史等方面与其相应对照组间无统计学差异。我们发现AD患者单核细胞总体及亚群Aβ42摄取功能较对照组均降低,脑卒中患者单核细胞Aβ摄取功能较对照组无统计学差异。为探索AD患者血液单核细胞Aβ摄取障碍的潜在机制,我们检测了介导单核细胞Aβ胞内摄取的相关表面受体,包括Toll样受体2（Toll-like receptor 2,TLR2）、抗髓细胞表达触发受体2（triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2）、CD36、CD33以及巨噬细胞清道夫受体1（macrophage scavenger receptor 1,MSR1）。我们发现这其中仅TLR2受体表达在AD中显著下降,而其它相关受体表达在AD和CN间无显著差异。同时,为探究AD中单核细胞摄取Aβ进入胞内后其后续的Aβ降解功能是否异常,我们还检测参与Aβ胞内降解的溶酶体酶的表达量,但均未在AD和CN间发现显著差异。4.增强单核细胞Aβ代谢功能对AD的干预作用和机制研究（1）云芝多糖对人源单核细胞Aβ代谢功能的影响我们的前期研究结果表明AD患者单核细胞TLR2表达降低,而TLR2可与CD14联结合所形成的复合物可介导单核细胞对Aβ的摄取,故AD患者单核细胞Aβ摄取功能障碍可能与TLR2表达降低有关。因此我们接下来探索了激活单核细胞TLR2是否可增强单核细胞Aβ摄取功能,以及是否可降低脑内AD病理并改善认知功能。从云芝栓菌中提取出的云芝多糖（polysaccharide krestin,PSK）可以刺激调节固有免疫途径,增强固有免疫细胞功能。而且,云芝多糖还是一种新型的Toll样受体2（Toll like receptor 2,TLR2）激动剂。因此,我们利用PSK激活单核细胞TLR2观察其对Aβ摄取的影响以及对AD的干预作用。采用流式细胞技术分析并计量单核细胞胞内FITC-Aβ42平均免疫荧光强度后发现,人单核细胞Aβ42胞内摄取随云芝多糖浓度（0-200μg/ml）升高出现先增加后降低的趋势,且100μg/ml为最佳干预浓度。进一步检测云芝多糖对单核细胞Aβ降解的影响,我们发现云芝多糖干预后单核细胞胞内Aβ42水平明显低于对照组,说明云芝多糖可促进单核细胞胞内Aβ42降解过程。通过检测介导人单核细胞Aβ摄取相关的主要表面受体发现,云芝多糖只显著升高单核细胞TLR2的表达。为进一步探究云芝多糖对单核细胞Aβ摄取功能的增强作用是否通过TLR2介导,我们在给予云芝多糖处理前加入TLR2拮抗剂,发现TLR2拮抗剂可几乎抵消云芝多糖对单核细胞Aβ摄取的增强作用。同时,通过计算EEA1+、Lamp1+和Lamp2+内Aβ+42的免疫活性区面积后发现,云芝多糖处理后单核细胞胞内溶酶体途径中有更多的Aβ42,说明云芝多糖能有效促进单核细胞胞内Aβ42的降解。（2）云芝多糖对APP/PS1小鼠认知功能的影响云芝多糖处理组的APP/SP1小鼠在Morris水迷宫中行为学表现均优于注射PBS对照组,表现为逃逸时间减少、穿越隐蔽平台的次数以及在目标象限探索时间显著增加。云芝多糖处理组APP/PS1小鼠在自发性交替实验中表现出更多的进臂总次数,在新臂探索实验中表现出更多的新臂探索次数。同时,云芝多糖处理组APP/SP1小鼠在矿场实验中探索距离也显著高于对照组。以上结果提示,云芝多糖能有效缓解AD小鼠认知功能障碍。（3）云芝多糖对APP/PS1小鼠脑内Aβ水平的影响本实验发现,云芝多糖能够显著较少APP/PS1小鼠脑内的致密性Aβ斑块（刚果红染色）及总Aβ斑块（6E10免疫组化染色）的数量和面积。ELISA定量分析进一步证实,云芝多糖可显著降低APP/PS1小鼠脑组织提取物Aβ及血液Aβ42含量。以上实验结果提示云芝多糖能够减轻APP/PS1小鼠脑实质及血液Aβ42的水平。通过流式细胞技术比较不同处理组小鼠单核细胞亚群的比例和Aβ42摄取功能发现,尽管小鼠血液单核细胞Ly6Clow/neg亚群的Aβ42摄取功能显著高于Ly6Chigh亚群,PSK处理组小鼠外周血单核细胞亚群比例与对照组无差异。但与对照组相比,PSK显著提高APP/PS1小鼠外周血单核细胞Aβ42摄取功能以及TLR2的表达量。通过检测脑内Aβ产生和清除过程中的相关分子水平发现,云芝多糖并不影响APP/PS1小鼠脑内APP表达,也不影响APP剪切酶的表达和活性,对脑内Aβ降解酶的表达亦无影响,表明PSK并不是通过减少脑内Aβ产生或者促进脑内Aβ降解来降低脑内Aβ含量。因此,云芝多糖可能主要通过提高单核细胞TLR2表达促进单核细胞Aβ外周清除功能,进而降低脑内Aβ水平。此外,云芝多糖还降低APP/PS1小鼠血脑屏障晚期糖基化终末产物受体（RAGE）的表达,减少Aβ从外周进入中枢,促进脑内Aβ流向外周被单核细胞清除。（4）云芝多糖对APP/PS1小鼠AD相关病理的影响与对照组相比,云芝多糖处理组APP/PS1小鼠海马内Neu N,MAP-2阳性面积显著增高,Caspase-3阳性染色水平显著降低,星形胶质细胞和小胶质细胞活化水平亦显著降低。此外,云芝多糖处理组的促炎症细胞因子水平显著低于对照组。云芝多糖皮层p Ser231-Tau阳性面积明显低于对照组。免疫蛋白印迹检测进一步发现,与对照组相比,云芝多糖组APP/PS1小鼠脑内的tau丝氨酸396位点磷酸化水平显著降低。云芝多糖处理组和对照组在APP/PS1小鼠脑内tau（Tau5）表达上无统计学差异。讨论本研究发现认知功能正常人群血液单核细胞Aβ摄取功能与血液Aβ水平紧密相关,提示单核细胞可能在Aβ外周清除中发挥重要作用。但我们发现,单核细胞的Aβ摄取功能随着年龄增长逐渐降低到。值得注意的是,单核细胞经典型亚群和非经典型亚群的Aβ摄取功能改变分别从20和40岁开始,提示单核细胞亚群的Aβ摄取功能变化是一个持续性过程且可能早于脑内Aβ沉积。此外,我们发现单核细胞的Aβ摄取功能在AD患者中进一步降低,但在脑卒中患者与相应对照组间未见显著差异,提示单核细胞Aβ摄取功能的改变可能特异性存在于AD患者中。与单核细胞Aβ摄取随年龄增长的改变不同,AD患者不仅经典型亚群和非经典型亚群的Aβ摄取功能降低,其中间型亚群Aβ摄取也较对照组降低。本研究证明中间型亚群是单核细胞三个主要亚群中对Aβ摄取功能最强一类亚群,且该亚群在Toll样受体受到刺激后,可大量分泌抗炎因子白介素-10（IL-10）。故CD14+CD16+亚群的功能障碍不仅会影响对Aβ识别功能损害,还可能导致具有神经元和认知功能保护作用的抗炎因子IL-10的分泌减少,从而加重AD的相关病理。AD患者单核细胞Aβ摄取能力下降的潜在机制尚不明确。我们在对主要介导单核细胞识别Aβ的细胞表面受体包括TLR2、CD33、CD36、TREM2、MSRA1等进行检测后发现,仅TLR2在AD中表达是下调的。TLR2属于Ⅰ型跨膜模式识别蛋白,其作为识别Aβ的天然固有免疫受体,可与CD14结合形成受体复合物共同介导单核细胞Aβ的摄取。而删除或者抑制CD14-TLR受体复合物后,将会损害人单核细胞对Aβ的摄取功能以及AD小鼠模型的认知功能。前期研究已说明单核细胞Aβ的胞内代谢途径。简述之,Aβ经单核细胞表面受体介导摄取入胞内后,形成早期内吞体,再与溶酶体结合并最终被水解酶混合物降解。且溶酶体中的组织蛋白酶D（天冬氨酸酶）和组织蛋白酶S（半胱氨酸酶）被证实可介导胞内Aβ降解。但在本研究中,我们未发现AD患者和对照组的组织蛋白酶D和S表达量有差异,提示AD单核细胞Aβ代谢功能障碍可能主要取决于对Aβ识别功能受损。以此为据,促进单核细胞TLR2的表达或可提高单核细胞Aβ摄取能力,促进脑内Aβ的外周清除。前期研究证实,变色栓菌云芝的提取物云芝多糖（polysaccharide krestin,PSK）,因其对固有免疫途径的有效调节作用已被作为处方药广泛应用于多种癌症的治疗。本研究发现云芝多糖不仅能增强单核细胞对Aβ的代谢功能,还能有效改善APP/PS1小鼠的认知功能损害及AD相关病理。为探究云芝多糖可有效促进单核细胞对Aβ的摄取以及胞内降解的潜在机制,我们检测了主要参与单核细胞Aβ摄取的表面受体,发现云芝多糖只增强TLR2的表达。此外,在提前加入TLR2拮抗剂后,云芝多糖对单核细胞激活作用几乎被抵消,说明云芝多糖对单核细胞Aβ摄取的促进作用是由TLR2受体介导的。同时,对单核细胞Aβ与EEA1、LAMP1、LAMP2的共定位免疫反应区评估后发现,云芝多糖处理后的单核细胞在胞内溶酶体途径中存在更多的Aβ,这表明PSK可促进单核细胞对Aβ胞内提呈和降解途径。值得注意的是,在APP/PS1小鼠在脑内Aβ开始沉积前给予云芝多糖的处理可降低小鼠脑内Aβ含量。我们并未发现云芝多糖处理小鼠脑内APP及其代谢产物、Aβ产生与降解相关蛋白酶在表达量上与对照组小鼠有统计学差异,说明云芝多糖并未影响小鼠脑内Aβ产生及降解过程。我们还发现,介导Aβ由外周经血脑屏障进入中枢的受体RAGE在云芝多糖处理小鼠中表达降低,提示PSK减少了由外周系统进入脑内的Aβ含量减少,也为云芝多糖激活的单核细胞在外周Aβ清除中发挥作用提供更多空间。以上结果表明,云芝多糖的作用可能主要是通过增强外周单核细胞对Aβ的识别和代谢,从而诱导脑内可溶性Aβ流入周围并被清除。此外,我们发现云芝多糖可通过减少APP/PS1小鼠脑内神经元丢失、凋亡、树突棘萎缩以及脑内神经炎症的发生,发挥神经元保护作用的同时维持脑内内环境稳态。AD中的另一病理特征,是由Tau蛋白过度磷酸化引起的神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFT）。本研究中,云芝多糖可抑制由Aβ诱导的不同位点的Tau蛋白磷酸化,从而降低磷酸化Tau蛋白的毒性作用。结论本研究提示血液单核细胞参与Aβ的外周清除;单核细胞Aβ摄取功能障碍可能参与AD的发生;增强血液单核细胞的Aβ清除能力具有AD防治潜力。