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[背景和目的]肺腺癌(lung adenocarcinoma,LAC)是最常见的肺癌病理类型,放射治疗(radiotherapy,RT)是主要的治疗手段之一。放疗后肿瘤负荷减少,还可在一定程度上诱导局部和全身的抗肿瘤免疫反应,联合免疫治疗可产生协同作用。但是也有研究表明,电离辐射(ionizing radiation,IR)还可能诱导上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)等增加残余细胞的侵袭能力,并通过多种作用途径增强肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)及全身的免疫抑制,从而促进局部肿瘤复发甚至远处转移。垂体瘤转化基因1(pituitary tumour transforming gene 1,PTTG1),是调节有丝分裂姐妹染色单体分离的关键基因之一,在LAC组织和细胞系中表达上调,并与LAC患者淋巴结转移有关,课题组前期研究显示PTTG1可通过TGF-β1/SMAD3信号通路调控LAC细胞的侵袭和增殖能力,转化生长因子-β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)是 TGF-β超家族主要成员,具有多种生物学功能,许多证据表明TGF-β1/SMAD3通路所介导的EMT和免疫调控影响肿瘤细胞的增殖、活化、侵袭转移和免疫微环境等。故探索LAC放射后侵袭转移能力和免疫功能变化,并探究PTTG1和TGF-β1/SMAD3通路在其中的作用,助于深入了解放射后LAC细胞生物学行为变化及与放射免疫的联系,进而为提高RT疗效研究提供理论依据和潜在的干预靶点,最终使LAC患者受益。[方法]1.通过RNA干扰沉默LAC细胞中PTTG1和SMAD3的表达;慢病毒载体介导短发夹RNA-PTTG1(Lv-shRNA-PTTG1)感染人LAC细胞A549,以构建PTTG1 敲减稳定细胞株(A549P-);小干扰 RNA-SMAD3(siRNA-SMAD3)转染A549P-细胞以构建双基因沉默细胞株(A549P-S-)。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot,WB)用于检测各基因被敲减的效率、侵袭转移相关基因蛋白及TGF-β1/SAMD3通路中关键基因和蛋白的表达。不同剂量X线(0、4、8 Gy)照射各组肿瘤细胞后,Transwell侵袭实验被用于检测各组细胞侵袭能力变化。2.采集健康志愿者新鲜外周血,利用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),构建各组肿瘤细胞和 PBMCs的共培养体系,A549P-细胞与PBMCs共培养48小时(hour,h)后接受不同剂量X线(0、4、8Gy)照射,照射后48h通过流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测免疫功能相关指标(调节性T细胞、CD8+T细胞、主要组织相容性复合体-I)。A549P-S-细胞与PBMCs共培养24h后行X线照射,并于照射后24h行FCM检测上述指标。3.通过Lv-shRNA-PTTG1感染表达荧光素酶基因的小鼠Lewis肺癌细胞(LLC-LUC)以构建 PTTG1 稳定敲减细胞株(shRNA-PTTG1)。QRT-PCR 和WB验证LLC-LUC中PTTG1基因的敲减效率。利用经胸膜针刺注射法将LLC-LUC-接种于BALB/c小鼠肺部以建立小鼠肺癌原位移植瘤模型。通过小动物活体成像(生物发光成像)定期观察肿瘤生长、侵袭和转移情况。于成瘤后一周给予荷瘤小鼠单次大剂量X线局部肿瘤照射(6MV-X线,,15Gy),照射后3日处死小鼠,收集血液、肿瘤组织、肺脏、脾脏和淋巴结标本,FCM检测免疫指标(同体外实验免疫指标);WB和免疫组织化学检测组织中TGF-β1、SMAD3等表达情况。[结果]1.成功构建A549细胞的PTTG1基因敲减细胞株(A549P-)和双基因敲减细胞株(A549P-S-)。A549细胞接受8Gy-X线照射后侵袭能力减弱,而在4Gy照射后无明显变化;暴露于同一剂量X线照射后,A549P-侵袭能力弱于对照组;照射后细胞 MMP-2、N-cadherin、Snail1 和 TGF-β1mRNA 表达降低,E-cadherin基因和蛋白表达上调,部分与照射剂量相关,相比对照组,A549P-组的变化更显著,包括SMAD3和p-SMAD3蛋白的变化。A549P-S-细胞在0、4、8Gy-X线照射后,侵袭能力显著弱于A549P-阴性对照细胞。2.LAC细胞A549与PBMCs共培养后,细胞生长受到相互抑制。不同剂量X线照射共培养体系后免疫功能获得增强,但不同免疫指标对X线剂量的反应具有差异:在对照组细胞共培养体系中,Tregs 比例的降低不随照射剂量变化而变化(4Gy与8Gy无差异),而CD8+T细胞和MHC-I分子的增加与照射剂量密切相关(只在8Gy照射后升高)。在A549P-细胞的共培养体系中,沉默PTTG1后增强OGy和4Gy照射后MHC-I分子和CD8+T细胞表达。继续干扰A549P-细胞中SMAD3表达后,降低8Gy照射后Tregs 比C例,增加4Gy照射后MHC-I分子和8Gy照射后CD8+T细胞比例。3.成功敲减小鼠Lewis肺癌细胞LLC的PTTG1表达(LLC-shRNA-PTTG1)并构建阴性对照细胞株(LLC-shRNA-NC),原位LLC小鼠移植肿瘤模型成功建立(分为PTTG1组和NC组)。接种肿瘤细胞后,约5-7天成瘤,8-10天开始体重不增,逐渐出现LAC相关症状。生物发光成像显示:两组小鼠成瘤率无差异,但PTTG1组瘤体小于NC组、转移率低于NC组;PTTG1、NC组中位生存期分别为30天、20天,差异无统计学意义。NC组荷瘤小鼠经X线胸部照射后,肿瘤组织、血液和外周淋巴器官中Tregs显著上调,MHC-I分子和CD8+T细胞在部分免疫器官中上调;而PTTG1组中,X线照射后Tregs无明显变化,各组织和免疫器官中MHC-I分子和(或)CD8+T细胞比例进一步提高。肿瘤和肺组织的IHC和WB实验显示,PTTG1组在照射后TGF-β1、SAMD3表达下调。[结论]1.PTTG1通过TGF-β1/SMAD3通路影响EMT调控放射后LAC细胞的侵袭能力,并影响Tregs和MHC-I分子调节放射后CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。2.小鼠Lewis肺癌中,PTTG1的敲减可通过影响TGF-β1/SMAD3通路活性削弱放射诱导的免疫抑制、增强放射诱导的局部和全身的抗肿瘤免疫反应,进而减少LAC的转移。3.靶向PTTG1和TGF-β1/SAMD3通路可能是提高LAC放射治疗和联合免疫治疗疗效的策略之一。