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围绝经期综合征（Perimenopausalsyndrome，MPS）是由于卵巢功能逐渐衰竭导致体内雌激素缺乏而引起的焦虑等不适，严重时还会引起骨质疏松等疾病。女性寿命的延长和相对固定的绝经年龄使得MPS对女性的健康及生存质量造成严重影响。我们针对围绝经期近期症状焦虑和远期症状骨质疏松的药物应用进行研究。
雌激素替代疗法（Estrogenreplacementtherapy，ERT）是临床治疗MPS的主要手段。研究表明雌二醇可通过调节兴奋性与抑制性递质平衡发挥抗焦虑作用。在骨代谢中，雌激素主要以非基因组方式快速激活成骨细胞Ras/MEK/ERK、PI3K/Akt信号通路，促进骨形成；也可以通过RANKL直接影响破骨细胞形成相关的下游信号通路，包括NF-κB、Akt、MAPK（p38、ERK和JNK），影响c-Fos、NFATc1和酒石酸酸性磷酸酶（Tartaricacidphosphatase，TRAP）等破骨细胞分化相关基因的表达。
ERT增加患者乳腺癌等发病率限制了其在临床的广泛应用，作用温和的植物雌激素因而成为人们关注的焦点。临床研究表明补肾方剂，如金匮肾气丸等对MPS具有良好的防治疗效。
青盐方（Qingyanformula,QYF）是古代经典补肾方剂，载于宋?《圣济总录》，由青盐、蜀椒、肉苁蓉、牛膝、巴戟天组成，方中五味药皆入肾经。巴戟天补肾阳，为君药，肉苁蓉补肾阳、益精血，为臣药，佐以牛膝、蜀椒，牛膝活血脉、补肝肾，既补且行能引药入肾经，蜀椒温补脾阳，青盐为使药，能引诸药入肾经，全方调补肾气，补肾温阳。课题组前期研究表明青盐方70%乙醇提取物（Qingyanformula70%ethanolextract,QYFE）具有雌激素样作用，且雌激素样作用优于青盐方水提物、95%乙醇提取物、原方打粉，可以促进未成熟小鼠生殖靶器官子宫、阴道的生长发育；还可抑制去双侧卵巢（Bilateralovariectomized，OVX）大鼠生殖靶器官萎缩，恢复OVX大鼠的动情周期，升高血清E2的水平，且对生殖系统具有一定的安全性。那么QYFE是否可以缓解围绝经期焦虑及骨质疏松呢？是否通过发挥雌激素样作用来达到治疗效果？
基于以上背景，我们选择美国食品与药品监督管理局和世界卫生组织推荐研究雌激素水平下降的OVX大鼠动物模型进行实验，该模型是当前最成熟、应用最广泛的造成动物雌激素分泌不足，模拟绝经后状态的方法。
第一部分QYFE在OVX焦虑大鼠模型中抗围绝经期焦虑的药效及初步机制探讨
目的：考察QYFE是否具有抗围绝经期焦虑的作用以及其发挥作用的机制
方法：首先采用检测焦虑样行为的经典行为学实验：旷场实验和O迷宫实验，选择具有焦虑症状的OVX大鼠作为研究对象，在给药QYFE12w后再次采用旷场实验和O迷宫实验考察大鼠在旷场中的总活动距离、中央场的活动时间和活动距离，以及大鼠在O迷宫中的总活动距离、开臂区域中的活动时间及活动距离，采用TopScan3D动物常规实验行为分析系统统计数据，判断QYFE是否具有抗焦虑的作用，并通过ELISA检测血清中神经递质的含量变化。
结果在行为学药效实验中，各组旷场实验和O迷宫实验的总活动距离均无显著性差异。与OVX组相比，QYFE可增加OVX焦虑大鼠在旷场实验中央场的活动时间和活动距离（***P＜0.001，**P＜0.01或*P＜0.05），增加OVX焦虑大鼠在O迷宫实验中开臂区域的持续时间和活动距离（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。两个行为学实验结果说明QYFE可改善OVX大鼠的焦虑状态。
在神经递质的检测中，QYFE可升高OVX大鼠血清5-羟色胺（Serotonin/5-hydroxytryptamine，5-HT）、γ氨基丁酸（Gammaaminobutyricacid，GABA）水平，显著降低谷氨酸（Glutamate，Glu）、去甲肾上腺素（Norepinephrine，NA）水平，这也许与其缓解去卵巢大鼠焦虑障碍有关。其升高抑制性递质GABA水平，降低兴奋性递质Glu水平，逆转OVX引起的兴奋性/抑制性递质平衡的紊乱，也可能是QYFE发挥抗焦虑作用的机制之一。
第二部分QYFE在OVX骨质疏松大鼠模型中抗骨丢失的药效、网络靶标预测及实验验证研究
目的：考察QYFE是否具有缓解OVX骨质疏松大鼠骨丢失的作用，采用网络药理学预测可能的作用信号通路并进行实验验证
方法：（1）药效实验中，采用双侧OVX大鼠动物模型，经阴道涂片连续5d为动情间期的OVX大鼠及行假手术大鼠为研究对象，取右侧股骨进行HE染色和TRAP染色，采用ELISA检测血清生化指标，并采用Micro-CT检测左侧股骨松质骨和皮质骨的结构。（2）在机制研究之前，我们采用网络药理学的方法对QYFE防治骨质疏松可能作用的信号通路进行了预测。首先在数据库TCMSP收集QYF中生物利用度（Oralbioavailability,OB）大于40%，类药性（Drug-likeness,DL）大于0.2的活性化合物及其靶标信息；然后在genecards网站查询骨质疏松所对应的靶标；之后统计QYF中所含化合物与疾病骨质疏松的共同靶标。采用cytoscape软件绘制QYF的调控网络图。在网站STRING中绘制蛋白互作PPI图，并对其中联系最密切的前20位基因进行了统计；随后对QYF与骨质疏松的共有基因进行GO和KEGG富集分析。（3）在成骨细胞增殖与分化实验中，采用人骨肉瘤细胞MG-63为研究对象，QYFE给药后采用MTT实验检测细胞增殖情况，采用碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase，ALP）试剂盒检测成骨细胞中ALP活性，采用雌激素受体（Estrogenreceptor，ER）拮抗剂ICI182780、MEK1/2的特异性抑制剂PD98059、PI3K的特异性抑制剂wortmannin对MG-63细胞ALP的活性进行检测，观察其是否通过ER、MEK/ERK和PI3K/Akt通路发挥作用，并讨论了这两条通路中磷酸化蛋白的最佳作用时间及QYFE对ERK、Akt磷酸化蛋白表达的影响。（4）在破骨细胞分化的研究中通过RANKL诱导RAW264.7形成破骨细胞模拟破骨细胞的形成过程，用TRAP染色、TRAP酶活性检测观察QYFE对破骨细胞形成的作用；并采用MTT实验考察QYFE对RAW264.7细胞的活性作用；通过WesternBlot法检测破骨细胞形成相关信号通路蛋白的表达，探索QYFE在RANKL诱导破骨细胞分化过程中影响破骨细胞形成的机制。
结果：（1）HE和Micro-CT结果显示QYFE治疗后，松质骨的变化情况一致，与OVX组相比，被破坏的骨小梁结构得到了不同程度的修复，部分区域骨小梁间隔变小，骨小梁面积显著增加，骨小梁连接点显著增加，形态较规则，骨小梁数目明显变多，明显改善了骨质疏松状态。数据分析显示：与OVX组比较，QYFE高、中、低剂量组骨矿含量（Bonemineralcontent，BMC）、骨矿密度（Bonemineraldestiny，BMD）、骨体积分数（Bonevolumefraction，BVF）、连接密度（Connectivitydensity，CD）、骨体积密度（Fractionalbonevolume，BV/TV）、骨小梁厚度(Trabecularthickness,Tb.Th.)及骨小梁数目(Trabecularnumber,Tb.N.)均显著性提高（***P＜0.001，**P＜0.01或*P＜0.05），骨小梁分离度（Trabecularseparation,Tb.Sp.）值显著降低（**P＜0.01或*P＜0.05）。Micro-CT检测显示QYFE增加了皮质骨BMC、BMD、BVF、骨小梁连接密度(Connectivitydensity,CD)、皮质骨内周长(Innerperimeter,IP)及皮质骨截面面积(Corticalarea,CA)水平，皮质骨微观结构变得更致密和粗厚。TRAP染色结果显示QYFE降低了OVX大鼠股骨的破骨细胞数目。在血清生化指标检测中，QYFE升高了血清钙、磷水平，提高了OVX大鼠的骨矿化水平，同时改善了OVX导致的高骨转化，降低了骨形成生化指标骨碱性磷酸酶（Bonealkalinephosphatase，BALP）,骨钙素（Osteocalcin，BGP）,I型前胶原氨基端原肽(TypeIprocollagenaminoterminalpropeptide，PINP)的升高程度，并降低了骨吸收指标Ⅰ型胶原羧基末端肽（TypeIcollagencarboxyterminalpeptide，CTX-Ⅰ）的水平；说明QYFE具有缓解OVX大鼠骨丢失的作用。（2）通过网络药理学的预测结果，结合骨质疏松作用的文献研究，我们最终挑选了ER、PI3K/Akt、MAPK信号通路中的MEK/ERK进行后期机制的验证。（3）QYFE不仅可促进MG-63的增殖，而且可增强其单位蛋白的ALP活性，呈时间/剂量依赖性，说明QYFE可通过促进成骨细胞增殖及提高ALP活性发挥促进骨形成的功能。加入ER拮抗剂ICI182780后，QYFE对MG-63细胞的增殖及ALP活性增强作用被减弱，说明QYFE通过ER途径对成骨细胞发挥促增殖及促分化作用；加入MEK1/2的特异性抑制剂PD98059、PI3K的特异性抑制剂wortmannin后，QYFE对MG-63细胞ALP的活性增强作用被减弱，说明QYFE还可通过MEK/ERK及PI3K/Akt途径对成骨细胞发挥促分化作用。QYFE对ERK和Akt表达水平无显著性差异，但可增强ERK和Akt的磷酸化水平，作用强度与雌二醇相当；分子机制与激活ER依赖性的MEK/ERK和PI3K/Akt通路相关。因此，QYFE促进骨形成是其发挥缓解骨丢失作用的机制之一。（4）QYFE降低了TRAP阳性多核破骨细胞的数目，并降低破骨细胞形成过程中TRAP酶的活性而抑制RANKL诱导的破骨细胞形成。MTT实验结果表明，无论RANKL存在与否，QYFE2~8μg/mL对RAW264.7细胞活性无抑制影响。说明其降低破骨细胞分化是由于其本身固有的作用，而非细胞毒性。QYFE下调p-ERK蛋白的表达，下调p-Akt蛋白的表达，ER拮抗剂ICI182780促进p-ERK蛋白表达，p-Akt蛋白不受ER拮抗剂ICI182780的影响。综上可知QYFE可通过降低TRAP阳性多核破骨细胞的数目，并降低破骨细胞形成过程中TRAP酶的活性而抑制RANKL诱导的破骨细胞形成，下调ER依赖性的p-ERK蛋白表达，下调ER非依赖性的p-Akt蛋白表达，发挥抑制骨丢失的作用。
第三部分QYFE中化学成分分析及抗骨丢失化学成分筛选
目的：考察QYFE中的化学成分并筛选具有抗骨丢失作用的化学成分
方法：我们采用HPLC对QYFE中的化学成分进行分析，并采用人骨肉瘤细胞MG-63进行经典的MTT法、ALP活性实验，采用RAW264.7细胞进行TRAP染色及TRAP活性检测，并检测了QYFE对RAW264.7细胞活性的影响；筛选具有抗骨丢失作用的化学成分。
结果：对QYFE中的化学成分的研究结果显示，分别含有水晶兰苷（Monotropein）392.8mg/kg、车叶草苷（Asperuloside）226.5mg/kg、麦角甾苷（Acteoside）332.5mg/kg、β-蜕皮甾酮（β-ecdysone）4933.8mg/kg。三种化合物益母草苷、尿囊素、去乙酰基车叶草苷酸均在2.5*10-7、5*10-7、10*10-7M不仅具有促进成骨细胞MG-63增殖的作用，还具有提高ALP活性的作用且呈现出剂量依赖性效应。同时，三者可抑制破骨细胞分化，且降低破骨细胞形成过程中TRAP酶的活性。三者对细胞活性无抑制影响，说明其对破骨细胞的抑制作用是因为本身的特性，而非毒性。因此益母草苷、尿囊素、去乙酰基车叶草苷酸均在2.5*10-7、5*10-7、10*10-7M时具有抗骨丢失的作用。
结论：经典补肾方剂青盐方对MPS近期症状焦虑及远期症状骨质疏松具有缓解作用：（1）QYFE具有抗围绝经期焦虑的作用，这种作用可能与其降低神经递质NA、Glu水平、升高5-HT、GABA的水平，逆转OVX引起的兴奋性/抑制性递质（Glu/GABA）平衡的紊乱有关；（2）QYFE改善了股骨松质骨和皮质骨的显微结构，降低了破骨细胞数目，改善了高骨转化状态，有效预防OVX后雌激素缺乏所致的骨质流失，其机制与通过ER途径促进成骨细胞增殖，提高单位蛋白ALP活性，激活ER依赖性的MEK/ERK和PI3K/Akt通路相关；此外，QYFE还可通过降低破骨细胞形成数量，抑制破骨细胞中TRAP酶活性而抑制破骨细胞生成，下调ER依赖性的p-ERK蛋白的表达，下调ER非依赖性的p-Akt蛋白表达，发挥抑制骨丢失的作用。（3）QYFE中抗骨丢失药效物质基础有益母草苷、尿囊素、去乙酰基车叶草苷酸等。该研究发现补肾经典方剂青盐方对雌激素水平低下动物模型具有抗焦虑及抗骨质疏松的新作用，为围绝经期综合征提供了候选药物。
雌激素替代疗法（Estrogenreplacementtherapy，ERT）是临床治疗MPS的主要手段。研究表明雌二醇可通过调节兴奋性与抑制性递质平衡发挥抗焦虑作用。在骨代谢中，雌激素主要以非基因组方式快速激活成骨细胞Ras/MEK/ERK、PI3K/Akt信号通路，促进骨形成；也可以通过RANKL直接影响破骨细胞形成相关的下游信号通路，包括NF-κB、Akt、MAPK（p38、ERK和JNK），影响c-Fos、NFATc1和酒石酸酸性磷酸酶（Tartaricacidphosphatase，TRAP）等破骨细胞分化相关基因的表达。
ERT增加患者乳腺癌等发病率限制了其在临床的广泛应用，作用温和的植物雌激素因而成为人们关注的焦点。临床研究表明补肾方剂，如金匮肾气丸等对MPS具有良好的防治疗效。
青盐方（Qingyanformula,QYF）是古代经典补肾方剂，载于宋?《圣济总录》，由青盐、蜀椒、肉苁蓉、牛膝、巴戟天组成，方中五味药皆入肾经。巴戟天补肾阳，为君药，肉苁蓉补肾阳、益精血，为臣药，佐以牛膝、蜀椒，牛膝活血脉、补肝肾，既补且行能引药入肾经，蜀椒温补脾阳，青盐为使药，能引诸药入肾经，全方调补肾气，补肾温阳。课题组前期研究表明青盐方70%乙醇提取物（Qingyanformula70%ethanolextract,QYFE）具有雌激素样作用，且雌激素样作用优于青盐方水提物、95%乙醇提取物、原方打粉，可以促进未成熟小鼠生殖靶器官子宫、阴道的生长发育；还可抑制去双侧卵巢（Bilateralovariectomized，OVX）大鼠生殖靶器官萎缩，恢复OVX大鼠的动情周期，升高血清E2的水平，且对生殖系统具有一定的安全性。那么QYFE是否可以缓解围绝经期焦虑及骨质疏松呢？是否通过发挥雌激素样作用来达到治疗效果？
基于以上背景，我们选择美国食品与药品监督管理局和世界卫生组织推荐研究雌激素水平下降的OVX大鼠动物模型进行实验，该模型是当前最成熟、应用最广泛的造成动物雌激素分泌不足，模拟绝经后状态的方法。
第一部分QYFE在OVX焦虑大鼠模型中抗围绝经期焦虑的药效及初步机制探讨
目的：考察QYFE是否具有抗围绝经期焦虑的作用以及其发挥作用的机制
方法：首先采用检测焦虑样行为的经典行为学实验：旷场实验和O迷宫实验，选择具有焦虑症状的OVX大鼠作为研究对象，在给药QYFE12w后再次采用旷场实验和O迷宫实验考察大鼠在旷场中的总活动距离、中央场的活动时间和活动距离，以及大鼠在O迷宫中的总活动距离、开臂区域中的活动时间及活动距离，采用TopScan3D动物常规实验行为分析系统统计数据，判断QYFE是否具有抗焦虑的作用，并通过ELISA检测血清中神经递质的含量变化。
结果在行为学药效实验中，各组旷场实验和O迷宫实验的总活动距离均无显著性差异。与OVX组相比，QYFE可增加OVX焦虑大鼠在旷场实验中央场的活动时间和活动距离（***P＜0.001，**P＜0.01或*P＜0.05），增加OVX焦虑大鼠在O迷宫实验中开臂区域的持续时间和活动距离（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。两个行为学实验结果说明QYFE可改善OVX大鼠的焦虑状态。
在神经递质的检测中，QYFE可升高OVX大鼠血清5-羟色胺（Serotonin/5-hydroxytryptamine，5-HT）、γ氨基丁酸（Gammaaminobutyricacid，GABA）水平，显著降低谷氨酸（Glutamate，Glu）、去甲肾上腺素（Norepinephrine，NA）水平，这也许与其缓解去卵巢大鼠焦虑障碍有关。其升高抑制性递质GABA水平，降低兴奋性递质Glu水平，逆转OVX引起的兴奋性/抑制性递质平衡的紊乱，也可能是QYFE发挥抗焦虑作用的机制之一。
第二部分QYFE在OVX骨质疏松大鼠模型中抗骨丢失的药效、网络靶标预测及实验验证研究
目的：考察QYFE是否具有缓解OVX骨质疏松大鼠骨丢失的作用，采用网络药理学预测可能的作用信号通路并进行实验验证
方法：（1）药效实验中，采用双侧OVX大鼠动物模型，经阴道涂片连续5d为动情间期的OVX大鼠及行假手术大鼠为研究对象，取右侧股骨进行HE染色和TRAP染色，采用ELISA检测血清生化指标，并采用Micro-CT检测左侧股骨松质骨和皮质骨的结构。（2）在机制研究之前，我们采用网络药理学的方法对QYFE防治骨质疏松可能作用的信号通路进行了预测。首先在数据库TCMSP收集QYF中生物利用度（Oralbioavailability,OB）大于40%，类药性（Drug-likeness,DL）大于0.2的活性化合物及其靶标信息；然后在genecards网站查询骨质疏松所对应的靶标；之后统计QYF中所含化合物与疾病骨质疏松的共同靶标。采用cytoscape软件绘制QYF的调控网络图。在网站STRING中绘制蛋白互作PPI图，并对其中联系最密切的前20位基因进行了统计；随后对QYF与骨质疏松的共有基因进行GO和KEGG富集分析。（3）在成骨细胞增殖与分化实验中，采用人骨肉瘤细胞MG-63为研究对象，QYFE给药后采用MTT实验检测细胞增殖情况，采用碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase，ALP）试剂盒检测成骨细胞中ALP活性，采用雌激素受体（Estrogenreceptor，ER）拮抗剂ICI182780、MEK1/2的特异性抑制剂PD98059、PI3K的特异性抑制剂wortmannin对MG-63细胞ALP的活性进行检测，观察其是否通过ER、MEK/ERK和PI3K/Akt通路发挥作用，并讨论了这两条通路中磷酸化蛋白的最佳作用时间及QYFE对ERK、Akt磷酸化蛋白表达的影响。（4）在破骨细胞分化的研究中通过RANKL诱导RAW264.7形成破骨细胞模拟破骨细胞的形成过程，用TRAP染色、TRAP酶活性检测观察QYFE对破骨细胞形成的作用；并采用MTT实验考察QYFE对RAW264.7细胞的活性作用；通过WesternBlot法检测破骨细胞形成相关信号通路蛋白的表达，探索QYFE在RANKL诱导破骨细胞分化过程中影响破骨细胞形成的机制。
结果：（1）HE和Micro-CT结果显示QYFE治疗后，松质骨的变化情况一致，与OVX组相比，被破坏的骨小梁结构得到了不同程度的修复，部分区域骨小梁间隔变小，骨小梁面积显著增加，骨小梁连接点显著增加，形态较规则，骨小梁数目明显变多，明显改善了骨质疏松状态。数据分析显示：与OVX组比较，QYFE高、中、低剂量组骨矿含量（Bonemineralcontent，BMC）、骨矿密度（Bonemineraldestiny，BMD）、骨体积分数（Bonevolumefraction，BVF）、连接密度（Connectivitydensity，CD）、骨体积密度（Fractionalbonevolume，BV/TV）、骨小梁厚度(Trabecularthickness,Tb.Th.)及骨小梁数目(Trabecularnumber,Tb.N.)均显著性提高（***P＜0.001，**P＜0.01或*P＜0.05），骨小梁分离度（Trabecularseparation,Tb.Sp.）值显著降低（**P＜0.01或*P＜0.05）。Micro-CT检测显示QYFE增加了皮质骨BMC、BMD、BVF、骨小梁连接密度(Connectivitydensity,CD)、皮质骨内周长(Innerperimeter,IP)及皮质骨截面面积(Corticalarea,CA)水平，皮质骨微观结构变得更致密和粗厚。TRAP染色结果显示QYFE降低了OVX大鼠股骨的破骨细胞数目。在血清生化指标检测中，QYFE升高了血清钙、磷水平，提高了OVX大鼠的骨矿化水平，同时改善了OVX导致的高骨转化，降低了骨形成生化指标骨碱性磷酸酶（Bonealkalinephosphatase，BALP）,骨钙素（Osteocalcin，BGP）,I型前胶原氨基端原肽(TypeIprocollagenaminoterminalpropeptide，PINP)的升高程度，并降低了骨吸收指标Ⅰ型胶原羧基末端肽（TypeIcollagencarboxyterminalpeptide，CTX-Ⅰ）的水平；说明QYFE具有缓解OVX大鼠骨丢失的作用。（2）通过网络药理学的预测结果，结合骨质疏松作用的文献研究，我们最终挑选了ER、PI3K/Akt、MAPK信号通路中的MEK/ERK进行后期机制的验证。（3）QYFE不仅可促进MG-63的增殖，而且可增强其单位蛋白的ALP活性，呈时间/剂量依赖性，说明QYFE可通过促进成骨细胞增殖及提高ALP活性发挥促进骨形成的功能。加入ER拮抗剂ICI182780后，QYFE对MG-63细胞的增殖及ALP活性增强作用被减弱，说明QYFE通过ER途径对成骨细胞发挥促增殖及促分化作用；加入MEK1/2的特异性抑制剂PD98059、PI3K的特异性抑制剂wortmannin后，QYFE对MG-63细胞ALP的活性增强作用被减弱，说明QYFE还可通过MEK/ERK及PI3K/Akt途径对成骨细胞发挥促分化作用。QYFE对ERK和Akt表达水平无显著性差异，但可增强ERK和Akt的磷酸化水平，作用强度与雌二醇相当；分子机制与激活ER依赖性的MEK/ERK和PI3K/Akt通路相关。因此，QYFE促进骨形成是其发挥缓解骨丢失作用的机制之一。（4）QYFE降低了TRAP阳性多核破骨细胞的数目，并降低破骨细胞形成过程中TRAP酶的活性而抑制RANKL诱导的破骨细胞形成。MTT实验结果表明，无论RANKL存在与否，QYFE2~8μg/mL对RAW264.7细胞活性无抑制影响。说明其降低破骨细胞分化是由于其本身固有的作用，而非细胞毒性。QYFE下调p-ERK蛋白的表达，下调p-Akt蛋白的表达，ER拮抗剂ICI182780促进p-ERK蛋白表达，p-Akt蛋白不受ER拮抗剂ICI182780的影响。综上可知QYFE可通过降低TRAP阳性多核破骨细胞的数目，并降低破骨细胞形成过程中TRAP酶的活性而抑制RANKL诱导的破骨细胞形成，下调ER依赖性的p-ERK蛋白表达，下调ER非依赖性的p-Akt蛋白表达，发挥抑制骨丢失的作用。
第三部分QYFE中化学成分分析及抗骨丢失化学成分筛选
目的：考察QYFE中的化学成分并筛选具有抗骨丢失作用的化学成分
方法：我们采用HPLC对QYFE中的化学成分进行分析，并采用人骨肉瘤细胞MG-63进行经典的MTT法、ALP活性实验，采用RAW264.7细胞进行TRAP染色及TRAP活性检测，并检测了QYFE对RAW264.7细胞活性的影响；筛选具有抗骨丢失作用的化学成分。
结果：对QYFE中的化学成分的研究结果显示，分别含有水晶兰苷（Monotropein）392.8mg/kg、车叶草苷（Asperuloside）226.5mg/kg、麦角甾苷（Acteoside）332.5mg/kg、β-蜕皮甾酮（β-ecdysone）4933.8mg/kg。三种化合物益母草苷、尿囊素、去乙酰基车叶草苷酸均在2.5*10-7、5*10-7、10*10-7M不仅具有促进成骨细胞MG-63增殖的作用，还具有提高ALP活性的作用且呈现出剂量依赖性效应。同时，三者可抑制破骨细胞分化，且降低破骨细胞形成过程中TRAP酶的活性。三者对细胞活性无抑制影响，说明其对破骨细胞的抑制作用是因为本身的特性，而非毒性。因此益母草苷、尿囊素、去乙酰基车叶草苷酸均在2.5*10-7、5*10-7、10*10-7M时具有抗骨丢失的作用。
结论：经典补肾方剂青盐方对MPS近期症状焦虑及远期症状骨质疏松具有缓解作用：（1）QYFE具有抗围绝经期焦虑的作用，这种作用可能与其降低神经递质NA、Glu水平、升高5-HT、GABA的水平，逆转OVX引起的兴奋性/抑制性递质（Glu/GABA）平衡的紊乱有关；（2）QYFE改善了股骨松质骨和皮质骨的显微结构，降低了破骨细胞数目，改善了高骨转化状态，有效预防OVX后雌激素缺乏所致的骨质流失，其机制与通过ER途径促进成骨细胞增殖，提高单位蛋白ALP活性，激活ER依赖性的MEK/ERK和PI3K/Akt通路相关；此外，QYFE还可通过降低破骨细胞形成数量，抑制破骨细胞中TRAP酶活性而抑制破骨细胞生成，下调ER依赖性的p-ERK蛋白的表达，下调ER非依赖性的p-Akt蛋白表达，发挥抑制骨丢失的作用。（3）QYFE中抗骨丢失药效物质基础有益母草苷、尿囊素、去乙酰基车叶草苷酸等。该研究发现补肾经典方剂青盐方对雌激素水平低下动物模型具有抗焦虑及抗骨质疏松的新作用，为围绝经期综合征提供了候选药物。