水葫芦内生菌的分离纯化及其代谢产物的初步研究

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植物内生菌能够产生丰富多样的次生代谢产物,其结构新颖、功能独特、生物活性特殊,是新药物、新化合物的潜在资源,引起了国内外专家的高度重视。植物病原菌对农业生产构成了严重威胁,农药的大量使用导致化学农药残留问题日益严重,使生态环境受到了极大的破坏与污染。而植物内生菌次生代谢产物种类多、活性独特,是寻找环境友好型新型农药的宝贵资源。本文采用组织分离法,分别以LB、PDA为分离培养基,从水葫芦的根、茎、叶部分分离内生菌,获得7株内生菌,其中包含6株细菌和1株真菌。分别运用乙酸乙酯和丙酮对7株内生菌的发酵液和菌丝体进行了粗提,使用高效液相色谱仪对乙酸乙酯相粗提物和丙酮相粗提物分别进行HPLC检测;并以4株细菌和2株农业病原菌作为供试菌株对各级粗提物进行了抑菌活性初步筛选,发现内生真菌菌株C7次生代谢产物较丰富、抑菌活性较好。并以菌株C7为研究对象,进行次生代谢产物的分离与纯化。得出结论如下:1.内生菌的分离与鉴定:本论文采用组织分离法,以LB、PDA为分离培养基,从水葫芦的根、茎、叶部分分离得到了7株内生菌,其中包含6株内生细菌和1株内生真菌。先对7株内生菌的形态特征进行了简单的观察记录,最后又对其乙酸乙酯提取物和丙酮提取物进行了高效液相色谱(HPLC)分析,结果表明该7株菌各不相同,而且代谢产物丰富程度也不同。经分子生物学鉴定菌株C7为匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)。2.7株内生菌生物活性初步筛选:用滤纸片法测定了7株内生菌C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7的乙酸乙酯相和丙酮相对2株农业病原菌和4株细菌的抑菌活性。测定结果表明C1、C2、C3、C4、C5菌株的乙酸乙酯相和丙酮相对供试菌株均无抑制性;C6菌株的乙酸乙酯相对金黄色葡萄球菌有微弱的抑制性,丙酮相对枯草芽孢杆菌有微弱的抑制性;C7菌株的乙酸乙酯仅对供试细菌都有一定的抑制活性。综合以上分析,本实验选择菌株C7作为后续研究对象。3.匍枝根霉次生代谢产物和生物活性研究:将匍枝根霉放大培养一个月,经过溶剂浸取、萃取,旋干成膏状。采用常规的硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、凝胶柱层析、制备薄层层析以及重结晶等分离方法,从C7菌丝体和发酵液的合并提取物中分离纯化出8个化合物,利用现代波谱技术鉴定其中一个化合物为(22E,24R)-5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol。
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