桑黄是珍贵的大型药用真菌子实体，具有抗氧化抗癌护肝等功效。但是野生桑黄非常稀少，限制了桑黄的大规模工业化生产，使得其药用价值不能得到充分利用。漆酶是一种多酚氧化酶，是多铜氧化酶家族成员之一。漆酶能够分解木质素，氧化分解酚类物质等，因此，近年来环境保护，医药，造纸，食品等行业的专家学者开始关注漆酶，并且在某些行业漆酶的应用已经取得了显著的成绩和良好的效果，漆酶在这些行业中表现出极大的研究价值和应用潜力。尽管漆酶的应用已经取得一定的进展，但是桑黄自然界产量较少，国内对桑黄漆酶的深层发酵研究还处于起步阶段，因此利用分子生物学方法研究桑黄漆酶基因并制备表达桑黄漆酶的工程菌，对实现桑黄漆酶的大规模生产和桑黄漆酶在各行业的应用具有重要意义。本研究以桑黄菌株Phellinus igniarius-A为材料，利用简并引物和染色体步移技术对桑黄菌株Phellinus igniarius-A漆酶的基因进行了克隆，并构建了重组载体pPICZα A-lac，电击转化毕赤酵母GS115，用甲醇对其进行了诱导表达。同时对桑黄漆酶进行了分离纯化和酶学性质研究，主要研究结果如下：1．桑黄漆酶基因序列获取及分析根据真菌漆酶铜原子附近保守的氨基酸序列，设计简并引物，以桑黄基因组DNA为模板，经PCR扩增得到了一个1554bp的桑黄漆酶基因片段。运用染色体步移技术，PCR扩增得到大小为642bp的桑黄漆酶基因5’端序列和大小为288bp的3’端序列，扩增得到的三段序列通过DNAstar进行拼接，获得了全长为2329bp的桑黄漆酶基因组DNA。经过RT-PCR扩增得到了大小为1575bp的桑黄漆酶cDNA序列。在基因起始密码子上游66bp和198bp处分别发现了TATA盒和CAAT框，但在终止密码子的下游并没有发现Poly（A）结构，原因可能是PCR扩增长度不够导致。将DNA和cDNA的碱基序列进行比对发现：桑黄Phellinus igniarius-A漆酶基因包含内含子9个，外显子10个，内含子的长度大小不一，编码520个氨基酸,位于前端的21个氨基酸可能是桑黄漆酶的信号肽,对应蛋白分子量在55.7KD左右。氨基酸序列经Blast对比发现，该漆酶氨基酸序列与其他真菌漆酶氨基酸序列同源性均在60%以上。2．桑黄漆酶基因真核表达载体构建及其在毕赤酵母GS115中的表达根据桑黄漆酶cDNA序列，设计特异性引物扩增不含漆酶自身信号肽的漆酶cDNA,利用限制性内切酶EcoR I和Xba I对cDNA进行双酶切反应，连接到穿梭质粒pPICZαA中，成功构建重组载体pPICZαA-lac。重组载体pPICZαA-lac线性化后，电击转化到毕赤酵母GS115中，经甲醇诱导表达，在诱导4d开始出现漆酶活性，在诱导8d后，漆酶酶活达到最大值739U/L。3．桑黄漆酶分离纯化及酶学性质研究重组酵母发酵液经过盐析，透析，层析等分离纯化，纯化倍数为3.06倍，回收率为41.2%，经过SDS-PAGE凝胶电泳，在55.7KD左右出现特异性条带。该桑黄漆酶的最适温度是55℃，在45℃以下时，酶活性相对比较稳定，当温度达到65℃后，漆酶的稳定性急剧下降。最适pH为3.2，当pH为6时，稳定性最好，表明该漆酶偏好弱酸性。Fe3+、Fe2+等对桑黄漆酶有抑制作用，Ca2+、Zn2+、等对桑黄漆酶有一定的激活作用。虽然漆酶中是含有铜原子，但时Cu2+却对桑黄漆酶的的激活作用并不是出非常明显。