【摘 要】
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一、广西南宁地区片形吸虫的分子鉴定及遗传多态性分析目的:本研究选取核糖体内转录间隔区（ITS+）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基Ⅰ（NAD Ⅰ）、线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ（COX Ⅰ）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（pepck）这4个遗传分子标记,采用分子生物学的方法与技术鉴定广西南宁地区的片形吸虫种类,并分析其种群遗传多态性。方法:从南宁某屠宰场收集11头感染了片形吸虫的水牛的肝脏,分离获得151
【基金项目】
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国家寄生虫资源库项目：国家寄生虫资源库（No.2019-194-30）；
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一、广西南宁地区片形吸虫的分子鉴定及遗传多态性分析目的:本研究选取核糖体内转录间隔区（ITS+）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基Ⅰ（NAD Ⅰ）、线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ（COX Ⅰ）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（pepck）这4个遗传分子标记,采用分子生物学的方法与技术鉴定广西南宁地区的片形吸虫种类,并分析其种群遗传多态性。方法:从南宁某屠宰场收集11头感染了片形吸虫的水牛的肝脏,分离获得151条片形吸虫成虫,并孵育获得其虫卵。提取片形吸虫成虫的基因组DNA,PCR扩增ITS+、NAD Ⅰ和COX Ⅰ序列并测序,所得序列经NCBI在线BLAST做同源性分析,构建线粒体基因NADⅠ和COXⅠ单倍型网络图及系统进化树,结合pepck基因多重PCR的结果鉴定虫种;提取部分片形吸虫虫卵的基因组DNA,PCR扩增ITS+序列并测序;用BioEdit软件做多序列比对分析,掌握片形吸虫亲代及子一代的遗传变异情况。结果:共获得151条片形吸虫成虫,lTS+序列扩增产物长度约964bp,仅NN20-2样本是Fh型,与GcnBank中肝片形吸虫瑞士样本（登录号:MK321602）完全同源;NN17-11、NN20-9和NN20-14等三个样本携带巨片形吸虫和肝片形吸虫的双重序列特征,属于Fg/Fh杂合型,序列图谱上特定变异位点出现双峰,个体间双峰比值存在差异,NN17-11 为 Fg:Fh=1:1,NN20-9 和 NN20-14 为 Fg:Fh=1:5;其余147个样本是Fg型,可细分为19个亚型,其中NN4-1等100个样本与GenBank中巨片形吸虫越南样本（登录号:MN970009）完全同源,其余样品中共出现14个变异位点,多为双峰。线粒体基因NAD Ⅰ序列扩增产物长约535bp,有34个变异位点,细分为28种单倍型;COX Ⅰ序列扩增产物长约438bp,有22个变异位点,细分为21种单倍型,所有样本的NAD Ⅰ和COX Ⅰ均属于巨片形吸虫类群。pepck电泳结果显示NN17-11、NN20-2、NN20-9和NN20-14等4个样本出现巨片形吸虫和肝片形吸虫的双重条带,其它样本只有巨片形吸虫的单一条带。虫卵的ITS+序列检测结果显示,ITS-Fh型片形吸虫NN20-2成虫有1个虫卵（1/30）转变为Fg/Fh型;巨片形吸虫NN20-3成虫有5个虫卵（5/30）呈现Fg/Fh型,其余虫卵与母体基本一致。结论:广西南宁的片形吸虫种群以纯种巨片形吸虫为主,同时存在少量的杂合型片形吸虫;结合多个遗传标记进行分析,能够更加准确可靠地鉴定南宁片形吸虫虫种。二、快速诊断华支睾吸虫病的胶体金免疫层析试条研制与效果评价目的:研制特异性抗原Cs4快速诊断华支睾吸虫病的胶体金免疫层析试条,其次结合G蛋白与抗原同时双标金的方法进行改良,评价并比较两种试条的检测效果。方法:构让pET28b-Cs4重组表达载体,IPTG诱导Cs4重组蛋白（rCs4）的表达,使用组氨酸标签亲和纯化柱纯化rCs4;分别将SPA与rCs4包被在硝酸纤维素膜的合适位置,作为质控线和检测线,G蛋白单标记胶体金、G蛋白和Cs4抗原同时双标记胶体金分别作为检测探针,制备检测抗rCs4特异性抗体的单标金和双标金免疫层析试条。两种试条同时险测华支睾吸虫病（42份）、囊虫病（18份）、裂头蚴病（10份）、卫氏并殖吸虫病（17份）、日本血吸虫病（10份）和片形吸虫病（13份）患者以及健康者（42份）的血清,评价和比较两者的诊断价值。结果:单标金试条的敏感性为97.6%（41/42）,特异性为93.6%（103/110）,总符合率为94.7%（144/152）,双标金试条的敏感性为90.5%（38/42）,特异性为88.2%（97/110）,总符合率为88.8%（135/152）,两种试条的敏感性（P>0.25）、特异性（P>0.10）和总符合率（P>0.05）之间的差异均无统计学意义,但双标金试条的交叉反应略高。此外,用6μl血清即可检测,10-15min内观察试条的检测结果。结论:用Cs4抗原研制的胶体金免疫层析试条可以快速诊断华支睾吸虫病,且具有较高的诊断价值。
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