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目的：甲状腺乳头状癌（PTC）是最常见的甲状腺癌,随着超声诊断技术和计算机断层扫描（CT）技术的进步,其诊断率逐年增高,因此PTC发病机制的相关研究引起了科学界的广泛重视。AU富集元件RNA结合蛋白（AUF1）可以与多种mRNA的3’-非翻译（3’-UTR）区ARE结合并调节mRNA的稳定性。AUF1常与细胞的增殖、迁移和侵袭能力有关,并且在多种恶性肿瘤中发现AUF1的高表达往往提示预后不佳。2009年研究人员首次报道了AUF1在甲状腺癌中的关键作用,但并没有阐述其具体作用机制。三结构域蛋白58（TRIM58）隶属于E3泛素连接酶家族,该家族控制几乎整个蛋白质组的蛋白质稳定性。已有许多研究表明,TRIM58可以起到抑癌作用。锌指和含BTB结构域的蛋白2（ZBTB2）是一种转录因子,可调控多个转录过程,同样已被发现与多种肿瘤的发生相关。我们发现AUF1敲除的PTC细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为能力明显减弱,说明了AUF1在甲状腺癌的发展进程中起着重要的促进作用,AUF1敲除显著增加了TRIM58和ZBTB2的表达。当TRIM58和ZBTB2分别被shRNA抑制时,AUF1敲除的IHH4和TPC1细胞的增殖、迁移和侵袭的能力增强。此外,在TRIM58启动子上有两个ZBTB2结合位点（-719-709和-677-668）,在ZBTB2 3’-UTR上有两个AUF1结合位点（1250-1256和1258-1265）。这些结果共同表明,AUF1通过调节ZBTB2和TRIM58的表达影响甲状腺癌细胞。因此,本研究旨在阐明AUF1在甲状腺癌的发展过程中的具体分子机制,以期对甲状腺癌的深入理解及临床治疗提供理论基础。研究方法：第一部分:1、细胞培养两种常见的人源性甲状腺乳头状癌细胞系IHH4和TPC1细胞,Western blot检测细胞中AUF1的基础表达,慢病毒感染构建AUF1敲除的细胞系。2、细胞计数和平板克隆实验检测AUF1敲除细胞的增殖能力,Transwell实验来研究敲除AUF1后细胞的迁移和侵袭能力改变。3、SILAC筛选出AUF1敲除后表达增加最明显的基因TRIM58,在AUF1敲除的IHH4和TPC1细胞Western blot中,检测TRIM58表达水平。4、应用针对TIRM58的短发夹RNA（sh TRIM58）病毒敲除AUF1敲除的IHH4和TPC1细胞中TRIM58的表达,Western blot验证敲除效率。5、Ed U掺入实验检测TRIM58敲除对AUF1敲除细胞的增殖影响。6、Transwell实验检测TRIM58敲除对AUF1敲除细胞的迁移和侵袭能力影响。7、在AUF1敲除的IHH4和TPC1细胞中应用q RT-PCR检测TRIM58 mRNA的水平。8、放线菌素D检测TRIM58 mRNA稳定性实验。9、荧光素酶基因报告实验,对TRIM58的启动子活性进行检测,探究的转录活性变化。第二部分:10、应用生物信息学分析技术,检测甲状腺癌中与TRIM58共表达的基因ZBTB2,以及ZBTB2与TRIM58启动子区、AUF1与ZBTB2的3’-UTR区的结合位点。并使用相应位点缺失突变荧光素酶基因报告实验验证。11、染色质免疫沉淀（Ch IP）检测AUF1敲除的IHH4细胞ZBTB2与TRIM58启动子上的片段募集情况。12、Western blot检测AUF1敲除的IHH4和TPC1细胞中ZBTB2和TRIM58的表达。13、实时PCR检测在IHH4和TPC1细胞的AUF1敲除后ZBTB2 mRNA的表达。14、在IHH4和TPC1细胞中使用针对ZBTB2（sh ZBTB2）的shRNA抑制ZBTB2的表达,Western blot进行验证。15、应用Ed U及Transwell实验检测AUF1基因敲除的IHH4和TPC1细胞中,ZBTB2基因敲除后细胞的增殖和侵袭能力变化。16、q RT-PCR检测AUF1敲除的IHH4和TPC1细胞中ZBTB2 mRNA水平。17、新生RNA检测新生ZBTB2 mRNA水平。18、放线菌素D检测ZBTB2 mRNA的稳定性。19、生物信息学软件预测ZBTB2 3’-UTR上的潜在AUF1结合位点,结合位点突变荧光素酶报告分析AUF1敲除细胞中未发现荧光素酶活性的变化。20、RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验验证AUF1和ZBTB2 mRNA之间的相互作用。21、人甲状腺组织中进行Western blot检测AUF1,ZBTB2和TRIM58表达水平。22、人甲状腺组织中进行免疫组织化学染色检测AUF1,ZBTB2和TRIM58表达水平。结果：第一部分:1、IHH4和TPC1细胞中AUF1的基础表达呈高水平。2、AUF1敲除降低IHH4和TPC1细胞的增殖和侵袭能力。3、AUF1敲除的IHH4和TPC1细胞中TRIM58表达水平增加。4、TRIM58的上调与AUF1敲除介导的抑制IHH4和TPC1细胞的增殖和侵袭有关。5、AUF1敲除的IHH4和TPC1细胞中TRIM58mRNA水平增加,TRIM58 mRNA稳定性无变化。6、AUF1敲除通过增加启动子活性激活TRIM58转录。第二部分:7、染色质免疫沉淀（Ch IP）实验显示ZBTB2被募集到TRIM58启动子上的-705-585和-812-697片段,这在IHH4细胞中被AUF1敲除增强。AUF1基因敲除通过增加ZBTB2的表达激活TRIM58的表达。8、IHH4和TPC1细胞的AUF1敲除后ZBTB2 mRNA的水平增加。9、AUF1敲除的IHH4和TPC1细胞中,ZBTB2敲除后细胞的增殖和侵袭能力显著增加。10、AUF1敲除的IHH4和TPC1细胞中ZBTB2 mRNA水平增加而新生ZBTB2 mRNA水平无变化。11、AUF1敲除的IHH4和TPC1细胞中ZBTB2 mRNA的稳定性增加。12、AUF1通过与ZBTB2mRNA的3’-UTR结合促进其降解,潜在AUF结合位点突变荧光素酶报告基因分析显示对照组ZBTB2 3’-UTR的1250-1256和1258-1265段的荧光素酶活性增加,AUF1敲除细胞中未发现荧光素酶活性的显著变化。13、RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验证实了AUF1和ZBTB2 mRNA之间的相互作用。14、Western blot结果显示人类甲状腺乳头状癌组织中AUF1的表达增加,而ZBTB2和TRIM58减少。AUF1与ZBTB2和TRIM58呈负相关,而ZBTB2与TRIM58呈正相关。15、免疫组织化学染色发现,人类甲状腺乳头状癌组织中AUF1水平增加,而TRIM58和ZBTB2水平降低。结论：通过结合ZBTB2 3’-UTR来影响ZBTB2 mRNA的稳定性,下调ZBTB2的表达,从而影响TRIM58的转录激活,下调TRIM58表达,进而促进甲状腺乳头状癌细胞的增殖、迁移和侵袭。