养蚕在中国已有5000年历史,养蚕业在中国规模庞大,参与人员众多,家蚕的广泛养殖以及随之而来的蚕丝用品的大量使用导致家蚕过敏时有发生。家蚕过敏临床表现以过敏性哮喘为主,伴有过敏性鼻炎、结膜炎和过敏性皮炎。本研究结合蛋白组学和免疫学方法首次发现家蚕新过敏原HSP70蛋白,利用分子生物学方法成功克隆表达出重组HSP70蛋白,重组HSP70蛋白与家蚕过敏患者血清具有很强的免疫原性,并用其成功致敏小鼠建立了哮喘模型进一步验证了其免疫原性,最后通过细胞实验初步探讨了其致敏机理,这为家蚕引发的过敏的特异性治疗和诊断奠定了良好的基础。目的(1)通过蛋白组学和Western blotting(WB)的方法筛选出家蚕潜在的过敏蛋白并进行质谱鉴定。(2)获取过敏原HSP70的全基因序列,构建表达载体,诱导表达获得大量重组HSP70蛋白并进行免疫学鉴定。(3)通过HSP70重组蛋白建立小鼠过敏性哮喘模型,评价其免疫原性。(4)通过细胞实验初步探讨家蚕HSP70致敏机制。方法(1)从广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所获取实验所用的家蚕,提取家蚕总蛋白,进行2-D分离蛋白,再将蛋白转印到PVDF膜上,封闭后将膜与家蚕过敏患者血清进行共同孵育,后与辣根过氧化物酶标记的羊抗人Ig E抗体反应寻找其中的阳性斑点;取其中的7号斑点切胶酶解后,进行MALDI-TOF-MS分析,通过与家蚕肽指纹图谱进行比对鉴定该斑点;(2)合成HSP70蛋白基因并将其构建到pet-28a表达载体上,重组质粒转化至E.coli BL21,IPTG诱导基因表达,通过NI-NAT亲和层析获取高纯度蛋白;对重组蛋白进行过敏原性鉴定,包括WB实验、ELISA实验。(3)选用30只6-8周龄的BALB/c小鼠,饲养在SPF动物房,随机分为3组:粉尘螨粗提液组(HDM组)、HSP70重组蛋白组(HSP70组)和生理盐水对照组(control组)。HDM组用100μg尘螨粗浸液加4 mg氢氧化铝佐剂皮下注射致敏,HSP70组用100μg家蚕重组HSP70加4 mg氢氧化铝佐剂皮下注射致敏,control组注射等量生理盐水代替过敏原。第3、7天加强致敏,在第14天,HDM组和HSP70组同时用50μg尘螨粗浸液和重组HSP70蛋白滴鼻激发小鼠,control组用等量的生理盐水代替变应原。同样的方式连续7天,每天一次。第23天,利用乙酰甲胆碱诱导小鼠检测气道高反应性。第24天,脱颈处死小鼠,检测小鼠哮喘相关指标。(4)用重组家蚕HSP70蛋白刺激DC2.4细胞,通过流式细胞术方法检测共刺激分子CD40和CD80的表达。结果(1)通过蛋白组学和免疫学方法成功筛选出8个潜在过敏原,7号阳性斑点免疫原性较强,进行MALDI-TOF-MS质谱后,利用软件Mascot等搜索课查找到对应的开放阅读框(ORF)。(2)克隆HSP70蛋白基因序列并成功构建出p ET28a-HSP70表达载体,在大肠埃希杆菌E.coli BL21内高效表达,用NI-NAT亲和层析纯化获得大量可溶性重组蛋白。ELISA和Western Blot实验也表明家蚕HSP70蛋白与家蚕过敏患者阳性患者的血清内Ig E有较强的结合能力,而健康对照组结果为阴性。(3)利用乙酰甲胆碱诱导小鼠检测气道高反应性,结果显示:与control对比,家蚕HSP70蛋白组表现出明显的气道高反应性,随着乙酰甲胆碱浓度的逐步提高,其Penh值也不断增强。且该差异性具有显著性差异;利用ELISA方法检测血清中抗原特异性Ig E显示:HSP70组小鼠血清与家蚕HSP70重组蛋白反应性(OD450)为正常对照组的3倍多,有显著性差异(P﹤0.05);利用ELISA方法检测血清中抗原特异性Ig G1结果显示:HSP70组小鼠血清与家蚕HSP70重组蛋白反应性(OD450)为正常对照组的5倍多,有显著性差异(P﹤0.05);肺组织病理学切片可以看出:HDM组与HSP70蛋白致敏组小鼠肺组织支气管壁增厚,且血管周围支气管周围炎症细胞浸润,而正常组小鼠肺部支气管轮廓清晰无明显增厚,且在支气管和血管组织周围未发现炎症细胞浸润。结论本研究通过蛋白组学和免疫学方法首次发现了家蚕HSP70蛋白为其过敏原。通过构建HSP70蛋白表达载体大量表达纯化获得重组HSP70蛋白,经免疫学方法鉴定该蛋白具有良好的免疫原性。首次利用重组HSP70蛋白致敏小鼠建立了哮喘模型,进一步验证了其免疫原性。通过细胞实验也初步探讨了其致敏机理。这为其他过敏原的发现提供思路,同时为家蚕引发的过敏疾病的特异性治疗和诊断奠定了基础。