目的:气道重塑是支气管哮喘的最重要的病理特征之一,也是哮喘治疗的难点问题。气道上皮发生上皮细胞间叶化(EMT)被认为是导致上皮细胞屏障功能下降从而导致气道高反应性和气道重塑的起始和核心。近年来多项研究已经证实间充质干细胞的回输治疗能够改善哮喘导致的气道重塑的进展,但是其改善气道重塑的具体机制尚不明确。近些年的一些研究指出,干细胞分泌的外泌体能够通过回输达到与回输干细胞近似的效果。外泌体中包含大量蛋白质,DNA,RNA和脂类物质,其中的microRNA(miRNA)是一种长度在20-25个核苷酸的单链小分子RNA,它能通过与靶基因3’-UTR区域的特定序列配对以降解mRNA,因此MSC外泌体中某种高表达的miRNA可能与其抑制EMT相关信号通路机制相关。本项研究中,我们通过给哮喘模型大鼠回输大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)或单独回输BMMSC外泌体,证实其能够通过抑制EMT相关的通路,并从MSC外泌体miRNA的方向研究其对EMT通路的影响,尝试解释MSCs改善气道重塑的部分机制。研究方法:1.大鼠骨髓间充质干细胞的分离、鉴定及其外泌体的提取1.1利用BMMSCs快速贴壁和高增殖能力的特性,通过换液和传代纯化冲洗长骨骨髓获得的细胞,获得高纯度的大鼠BMMSCs。1.2流式检测P3 BMMSCs的CD34、CD45、CD90、CD105这些表面标志物。1.3 P3 BMMSCs通过成脂、成骨、成软骨诱导鉴定其分化能力。1.4通过免疫磁珠法提取BMMSCs无血清培养上清中的外泌体。1.5透射电镜观察提取的外泌体的形态和大小。1.6 WesternBlot(WB)检测提取的外泌体的标志蛋白表达量以鉴定其纯度。2.大鼠骨髓间充质干细胞及其外泌体通过Wnt/β-catenin通路影响哮喘导致的气道重塑机制的研究。2.1实验第一部分中获得的大鼠骨髓间充质干细胞,及纯化的其外泌体,用PHK67荧光标记试剂盒对细胞和外泌体进行标记,标记完成后荧光显微镜下观察标记效果。2.2支气管哮喘模型大鼠的建立:4周龄SD大鼠每只腹腔注射1ml配置好的OVA+氢氧化铝乳剂,注射当日记为0d,7d再次腹腔注射1ml OVA溶液致敏。14d-19d用5%OVA对透明密闭容器中的造模大鼠进行雾化激发,每次30min。首次激发前1h按分组不同进行尾静脉注射;最后一次激发后1h麻醉大鼠进行后续采集操作(对照组以等体积的1×PBS代替致敏液和雾化激发液)。2.3实验分组实验大鼠分为6组,每组5只。Control组:用1×PBS进行致敏和激发和回输;Model组:OVA+氢氧化铝致敏,6天OVA雾化激发;Model+MSCs组:造模大鼠,雾化激发前静脉回输5×106BMMSCs;Model+Exo组:造模大鼠,雾化激发前静脉回输50ug BMMSCs外泌体:Model+MSCs+BML-284组:造模大鼠,雾化激发前静脉回输5×10~6BMMSCs,再注射1mg BML-284;Model+Exo+BML-284组:造模大鼠雾化激发前静脉回输50ug BMMSCs外泌体,再注射1mg BML-284。2.4收集各组大鼠的肺泡灌洗液,分析其中总细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的数量变化。2.5肺组织切片进行HE染色和Masson染色,分析各组大鼠肺部病理情况。2.6肺组织冷冻切片,荧光显微镜下观察回输的干细胞和外泌体向肺部的迁移情况。2.7 qPCR检测各组大鼠含支气管的肺组织中E-cadherin、Vimentin、Wnt、Frizzled、GSK-3β、、β-catenin、LEF1、Snail1、c-Myc的m RNA表达量的变化。2.8 WB检测各组大鼠含支气管的肺组织中E-cadherin、Vimentin、Wnt、Frizzled、GSK-3β、p-Ser-GSK-3β、p-Try-GSK-3β、β-catenin、LEF1、Snail1、c-Myc蛋白表达量的变化。3.大鼠间充质干细胞来源的外泌体中的MicroRNA通过抑制sonic hedgehog信号通路对哮喘气道重塑的影响3.1用大鼠miRNA芯片分析大鼠BMMSCs外泌体中高表达miRNA的种类。3.2通过生物信息学分析大鼠BMMSCs外泌体中高表达mi RNA中可能干预哮喘病程中EMT相关通路的靶基因。3.3使用双荧光素酶报告基因先在体外实验中验证,生物信息学分析后选择的miRNA miR-212-3p能够对其预测的靶基因Shh起到干扰作用。3.4细胞实验3.4.1原代大鼠支气管上皮细胞的分离培养。3.4.2原代大鼠支气管上皮细胞的免疫荧光鉴定。3.4.3原代大鼠支气管上皮细胞分组为8组进行刺激:Control组:细胞转染miR-212-3p NC后用常规完全培养基培养;TGF-β1组:细胞转染miR-212-3p NC后用含TGF-β1的完全培养基培养;TGF-β1+MSC组:细胞转染miR-212-3p NC后用含TGF-β1的完全培养基与MSCs共培养;TGF-β1+Exo组:细胞转染mi R-212-3p NC后用含TGF-β1的完全培养基与MSC外泌体共培养TGF-β1+miR-212-3p minics组:细胞转染miR-212-3p minics后用含TGF-β1的完全培养基培养;TGF-β1+mi R-212-3p inhibitor组:细胞转染miR-212-3p inhibitor后用含TGF-β1的完全培养基培养;TGF-β1+MSC+mi R-212-3p inhibitor组:细胞转染miR-212-3p inhibitor后用含TGF-β1的完全培养基与MSCs共培养;TGF-β1+Exo+miR-212-3p inhibitor组:细胞转染mi R-212-3p inhibitor后用含TGF-β1的完全培养基与MSC外泌体共培养。3.4.4细胞按上述分组干预72h提总蛋白,检测EMT和Shh相关蛋白:E-cadherin、Shh、Gli1、c-Myc。3.5动物实验3.5.1实验分组实验大鼠分为8组,每组5只。Control组:用1×PBS进行致敏和激发和回输;Model组:OVA+氢氧化铝致敏,6天OVA雾化激发;Model+MSCs组:造模大鼠,雾化激发前静脉回输5×106BMMSCs;Model+Exo组:造模大鼠,雾化激发前静脉回输50ug BMMSCs外泌体;Model+miR-212-3p agomir组:造模大鼠,雾化激发前静脉注射100μmol miR-212-3p agomir;Model+miR-212-3p anta组:造模大鼠,雾化激发前静脉注射100μmol miR-212-3p antagomir;Model+MSCs+miR-212-3p anta组:造模大鼠,雾化激发前静脉回输5×10~6BMMSCs,再注射100μmol miR-212-3p antagomir;Model+Exo+miR-212-3p anta组:造模大鼠雾化激发前静脉回输50ug BMMSCs外泌体,再注射100μmol miR-212-3p antagomir。3.5.2收集各组大鼠的肺泡灌洗液,分析其中总细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的数量变化。3.5.3肺组织切片进行HE染色和Masson染色,分析各组大鼠肺部病理情况。3.5.4 qPCR检测各组大鼠含支气管的肺组织中E-cadherin、Vimentin、Shh、Ptch、smo、Gli1、Snail1、c-Myc、Cyclin D1的mRNA表达量的变化。3.5.5 WB检测各组大鼠含支气管的肺组织中E-cadherin、Vimentin、Shh、Ptch、smo、Gli1、Snail1、c-Myc、Cyclin D1蛋白表达量的变化。结果:1.1获得的大鼠BMMSCs为典型成纤维样细胞且生长迅速。1.2流式检测结果显示检测的细胞为CD34、CD45阴性,CD90、CD105阳性的细胞,这符合MSCs的表型。1.3 P3 BMMSCs成脂、成骨、成软骨诱导后染色结果皆为阳性,说明分离的BMMSCs有良好的分化能力。1.4透射电镜照片显示提取的外泌体,直径为100nm左右,双凹圆盘状,符合外泌体的典型大小和状态。1.5 WB检测显示相较于细胞蛋白提取物,纯化的外泌体中CD9、CD63、CD81标志物的量显示出明显的上调,且β-actin的表达为阴性,说明提取的外泌体的纯度较好。2.1荧光显微镜下观察MSCs及其外泌体均成功的标记上了绿色荧光。2.2 BALF计数结果显示,总细胞数、淋巴细胞数、嗜酸性粒细胞数中性粒细胞数、在各组大鼠的BALF中的变化趋势均表现一致,Model组的细胞数相较Comtrol组均显著增加(P<0.001),而模型大鼠经过BMMSCs或BMMSC外泌体的回输治疗后,细胞数相对Model组均明显降低(P<0.001)。而用Wnt激动剂BML-284干预了回输治疗的大鼠后,无论是BMMSCs治疗的还是BMMSC外泌体回输治疗的分组,用BML-284干预后,细胞数均有明显上升(P<0.001)。2.3 HE染色和Masson染色的病理切片显示,Control组大鼠显示肺泡组织大小正常,未见明显的炎症细胞的浸润,气管下胶原沉积较少。而相对的Model组的肺组织表现出了明显的大量炎症细胞的浸润,肺泡的扩大和破损和大量的气管下胶原沉积。而大鼠经过BMMSCs或BMMSC外泌体的回输治疗后,炎症浸润的程度会明显降低,肺泡的大小明显降低,破损减少,气管下胶原沉积程度降低。而用Wnt激动剂BML-284干预了回输治疗的大鼠后,无论是BMMSCs治疗的还是BMMSC外泌体回输治疗的分组,相较其单纯治疗组,炎症的浸润、肺泡的损伤以及下胶原沉积又有明显的增加。2.4用荧光显微镜观察各组大鼠的肺组织冰冻切片,可以看到少数(每个视野2-4个)的标记后的MSCs和外泌体,说明静脉回输后间充质干细胞和外泌体均能迁移至肺部,但是数量较少。2.5 qPCR和WB检测的结果均显示在肺组织中,Model组相较Control组E-cadherin、GSK-3β的mRNA和蛋白,p-Ser-GSK-3β的蛋白表达量达均发生下调(P<0.001),Vimentin,Wnt、Frizzled、β-catenin/LEF1、Snail1和c-Myc mRNA和蛋白,p-Tyr-GSK-3β蛋白表达量均上升(P<0.001),说明了Model组EMT的发生,Wnt/β-catenin信号通路的激活及其下游细胞迁移和增殖转录因子的激活。而回输MSCs或者MSC的外泌体后,这两组相较Model组,E-cadherin GSK-3βmRNA和蛋白,p-Ser-GSK-3β的蛋白表达量的均出现上调(P<0.001),Vimentin,Wnt、Frizzled、β-catenin、LEF1、Snail1和c-Myc mRNA和蛋白,p-Tyr-GSK-3β蛋白表达量均下降(P<0.001),表示EMT程度,Wnt/β-catenin信号通路及其下游转录因子均受到抑制。而用Wnt通路激动剂BML-284干预回输治疗的两组模型大鼠则相较其单纯治疗组,表现出EMT程度的再度上升,Wnt/β-catenin信号通路及其下游转录因子的再度激活。3.1双荧光酶素报告基因检测的结果显示,在所有的6组共转染的分组中,仅有pmirGLO-Shh-3’UTR+mi R-212-3p mimics共转染组的萤火中荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性的比值发生了明显的下降(P<0.01),说明miR-212-3p能够特异性的识别Shh基因3’UTR的互补配对位点进而干扰其上游蛋白的表达。3.2细胞实验证实,在TGF-β1刺激大鼠支气管上皮细胞发生EMT的模型中,共培养的MSCs及其外泌体均能抑制上皮细胞的EMT和Shh通路的活化,单独转染的miR-212-3p minics也能抑制EMT并抑制Shh通路,而使用mi R-212-3p的抑制剂则能够降低MSCs及其外泌体均抑制上皮细胞EMT的效果。3.3 BALF计数结果显示,总细胞数、淋巴细胞数、嗜酸性粒细胞数中性粒细胞数、在各组大鼠的BALF中的变化趋势均表现一致,Model组的细胞数相较Comtrol组均显著增加(P<0.001),而模型大鼠经过BMMSCs或BMMSC外泌体的回输治疗后,细胞数相对Model组均明显降低(P<0.001)。而用miR-212-3p的阻断剂miR-212-3p antagomir干预了回输治疗的大鼠后,无论是BMMSCs治疗的还是BMMSC外泌体回输治疗的分组,干预后,细胞数均有明显上升(P<0.001)。模型大鼠注射miR-212-3p agomir相较Model组可以明显降低总细胞数以及三种免疫细胞的数量(P<0.01)。3.4 HE染色和Masson染色的病理切片显示,Control组大鼠示了肺泡组织大小正常,未见明显的炎症细胞的浸润,气管下胶原沉积较少。而相对的Model组的肺组织表现出了明显的大量炎症细胞的浸润,肺泡的扩大和破损和大量的气管下胶原沉积。而大鼠经过BMMSCs或BMMSC外泌体的回输治疗后,炎症浸润的程度会明显降低,肺泡的大小明显降低,破损减少,气管下胶原沉积程度降低。而用miR-212-3p的阻断剂miR-212-3p antagomir干预回输治疗的大鼠后,无论是BMMSCs治疗的还是BMMSC外泌体回输治疗的分组,相较其单纯治疗组,炎症的浸润、肺泡的损伤以及下胶原沉积又有明显的增加。模型大鼠单独的注射miR-212-3p agomir相较Model组可以降低肺部的炎症浸润和胶原沉积。3.5qPCR和WB检测的结果均显示,Model组的大鼠的含气管的肺组织中,相较Control组,E-cadherin m RNA和蛋白表达量达均发生下调(P<0.001),Vimentin,Shh、smo、Gli1、Snail1、c-Myc和Cyclin D1 mRNA和蛋白表达量均上升(P<0.001),说明了Model组EMT的发生,Shh信号通路的激活及其下游细胞迁移和增殖转录因子的激活。而回输MSCs或者MSC的外泌体后,这两组相较Model组,E-cadherin Ptch mRNA和蛋白表达量的均出现上调(P<0.001),Vimentin、Shh、smo、Gli1、Snail1、c-Myc和Cyclin D1 mRNA和蛋白表达量均下降(P<0.001),表示EMT程度,Shh信号通路及其下游转录因子均受到抑制。而用mi R-212-3p的阻断剂miR-212-3p antagomir干预回输治疗的两组模型大鼠则相较其单纯治疗组,表现出EMT程度的再度上升,Shh信号通路及其下游转录因子的再度激活。模型大鼠单独的注射miR-212-3p agomir相较Model组也可以明显抑制EMT以及Shh信号通路的激活。结论:1本实验中获得了高纯度,高增值和分化能力的大鼠BMMSC细胞和高质量的BMMSC外泌体。2.动物试验中证实MSCs确实可以通过其外泌体抑制Wnt通路,从而降低哮喘中气管上皮的EMT,降低气管下的胶原沉积,改善气管重塑。3.体外实验中,验证了miR-212-3p对其靶基因Shh基因的干扰能力。4.体外动物实验证实,MSCs及其外泌体的共培养可以抑制TGF-β1刺激导致的EMT和Shh通路激活,这一效果能够被miR-212-3p的抑制剂所阻断。5.体内实验中进一步验证了大鼠骨髓MSCs治疗大鼠哮喘的机制部分是通过MSCs外泌体中高表达的miR-212-3p降解肺中shh通路中的关键蛋白Shh的mRNA,从而降低Shh蛋白的水平,进而抑制Shh通路的激活而实现的。