芋螺(Cone snail,Conus)为海洋肉食性软体动物,世界上约有700种。根据其食性可将芋螺分为三大类:食鱼类(Piscivorous);食螺(其他软体动物)类(Molluscivorous);食虫(蠕虫)类(Vermivorous)。在捕猎时,芋螺将自身分泌的毒液通过齿舌注射入猎物体内,达到瞬间麻痹猎物的目的。芋螺毒素(肽)(Conotoxins,Conopeptides,CTxs)是指芋螺毒液中存在的各种各样的小分子活性多肽。根据CTxs前体肽高度保守的信号肽序列,可将种类繁多的芋螺毒素分为26个基因超家族,包括 A、Bl、B2、B3、C、D、E、F、G、H、I1、12、13、J、K、L、M、N、O1、02、03、P、S、T、V、Y。根据芋螺毒素的作用靶点,可分为α、μ、ω、δ、X、σ、λ、K、γ等药理学家族。α-芋螺毒素(α-Conotoxins,α-CTxs)是最早发现且研究最深入的一类芋螺毒素,一般由12-20个氨基酸和两对二硫键构成,是多种烟碱型乙酰胆碱受体(Nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)不同亚型的特异阻断剂。α-CTxs具有活性强、选择性高、分子构象稳定等特点,既可作为研究配体与乙酰胆碱受体相互作用、受体结构与功能、以及相关疾病发病机理的分子探针或工具药,还有望直接开发为治疗相关疾病的创新药物。nAChRs广泛分布于中枢和外周神经系统,是存在于身体各个组织中的一种具有重要生理功能的跨膜五聚体蛋白,并与多种疾病的发病密切相关,如疼痛、成瘾、帕金森氏症、精神分裂症、抑郁症、阿尔兹海默症、肺癌、乳腺癌等。目前发现构成nAChRs的亚基共 17 种,包括:α(1-10),β(1-4),γ,δ,ε。本论文针对特异阻断nAChRs不同亚型的α-芋螺毒素TxID、TxIB和RegIIA,大规模地进行序列结构的改造、合成,对所获得的突变肽靶点活性进行鉴定,深入研究其构效关系,获得了选择性更高的优化突变肽,阐明了突变肽与受体之间选择性相互作用的分子机理。主要包括以下三个部分。(1)α-CTx TxID的系统改造及其构效关系的研究。α-CTxTxID是本实验室从织锦芋螺(Ctextile 的毒液中发现的一种结构新颖的α4/6型芋螺毒素,对α3β4nAChR亚型的阻断活性最强,其半阻断剂量(Halfinhibiting concentration,IC50)仅为3.6nM,是目前发现的对该亚型活性最强的抑制剂之一。但TxID对α6/α3β4 nAChR亚型也具有较强的抑制作用,其IC50为33.9nM。野生型的TxID很难区分极其相似的α3β4与α6/α3β4nAChRs这两种亚型,其区分度在10倍以内。以前发现的α3β4nAChR阻断剂也都同时阻断α6/α3β4 nAChR。尽管我们通过TxID丙氨酸扫描突变,发现了对这两个亚型区分度提高到近50倍的突变肽[S9A]TxID,但仍然不能完全区分它们,对于研究α3β4与α6/α3β4 nAChRs这两种相似亚型的结构与功能、及其相关疾病的发病机理,还不能提供最有效的分子探针。为此,在前期TxID丙氨酸扫描结果的基础上,针对关键的第9位氨基酸位点,设计了 TxID一系列不同性质氨基酸替换的点突变体,人工合成了各个突变肽。利用表达在非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞膜上的各种nAChRs亚型的电生理筛选模型,对TxID及其所有突变肽的靶点结合活性和选择性进行了研究。结果表明,突变体[S9K]TxID能够专一性作用于α3β4nAChR,IC50仅为6.9 nM,而对包括α6/α3β4在内的其他所有测试过nAChRs亚型都无明显抑制作用,是迄今为止发现的活性最强、选择性最好的α3β4nAChR专一性阻断剂。同时,对[S9K]TxID的NMR三维空间结构进行了解析,比较了该突变肽与野生型TxID在结构上的差异。采用分子对接(Moleculardocking)技术,构建了野生型TxID分别与α3β4与α6/α3β4nAChRs亚型的同源结合分子模型,对配体与受体之间相互作用的分子机理进行了解析。(2)不同α-CTxs与α-眼镜蛇毒素对大鼠和人类α7nAChR亚型的阻断活性及其种属特异性差异的分子机理研究。α7nAChR是一种特殊的nAChR亚型,它是由五个相同的α7亚基构成的功能性同源五聚体跨膜通道蛋白。利用多种特异性作用于α7 nAChR的α-CTxs和α-眼镜蛇毒素作为配体研究对人鼠源α7 nAChR的作用活性时,我们发现配体对人鼠源α7 nAChR具有不同程度的活性差异,其中α-CTxs突变体[K11A]TxIB和[H5D]RegIIA对rα7和hα7nAChRs表现出>50倍的活性差异。比对人鼠源α7受体的N-端胞外配体结合区的序列发现,它们之间仅存在10个氨基酸的差异。利用基因定点诱变技术分别改造α7nAChR差异位点,以[K11A]TxIB和[H5D]RegIIA为配体验证对每种受体突变体活性的变化。结果表明,185位氨基酸差异(人源为Arg,鼠源为Lys)是导致人鼠源α7 nAChR对配体敏感性变化的最主要因素,并通过分子动力学模拟技术分析了这一现象的分子机制。该研究为专一性作用于α7 nAChR的多肽药物设计和改造提供了分子理论基础。(3)利用大肠杆菌生物法大量合成α-CTxTxIB。TxIB是从C.textile中获得的一种新型α4/7-CTx,它能够专一性抑制α6/α3β2β3nAChR,IC50为28nM。天然提纯的α-CTxs数量有限,而化学合成法合成α-CTxs的成本较高。为了在保持TxIB活性的前提下提高产量并降低生产成本,我们将编码TxIB的基因与原核表达载体pET-31b(+)融合构建重组载体,并导入大肠杆菌BLR(DE3)pLysS中诱导表达。通过镍亲和层析柱纯化、溴化氢(Cyanogenbromide,CNBr)切割、高效液相色谱(Reverse-phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)纯化等过程,最终获得重组 TxIB(RecombinantTxIB,rTxIB),并通过电生理技术验证rTxIB的活性。结果表明rTxIB表现出对α6/α3β2β3 nAChR的专一性阻断作用,其活性与天然TxIB相似。该研究为其他小分子多肽药物的生物法合成提供了一种简便、高效、可行的方法。综上,本课题采用分子生物学、多肽序列改造、受体定点突变、双电极电压钳和分子动力学模拟等多种技术相结合的方法,对α-CTxs与nAChRs的相互作用机制及α-CTxs的生物法合成进行了深入探究,研究结果为进一步了解配体-受体特异性作用的结构基础、指导α-CTxs专一活性突变肽的设计和合成、以及多肽药物的临床研究提供了理论依据。