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由于资源枯竭问题的日益严重,大型藻类和微藻类作为生产生物燃料的可再生和环保原料而受到越来越多的研究人员的关注。褐藻胶在海藻工业中产量最大、品种最多、用途最广,被广泛应用于各行业实践中。褐藻胶的降解产物---褐藻胶寡糖也具有诸多生物活性,近几年受到许多科研工作者的关注。由于褐藻胶寡糖的制备目前仍是研究的重点,制备方法中,生物酶解法最为高效,但与其相关的褐藻胶裂解酶,因活性低,不能工业化生产等缺点,是目前科研研究的重点难点。本文从前期分离的6株可降解海带的菌株中,筛选到褐藻胶裂解酶活性最高的菌株1e,并对1e进行了菌种鉴定、培养条件优化及褐藻胶裂解酶活性分析。随后,从1e菌种中克隆出3条不同的褐藻胶裂解酶基因,使用生物学软件分析了这三条基因的蛋白序列特点。最后,将基因分别在大肠杆菌和毕赤酵母进行异源表达,分析比较了这些过表达工程菌的产酶条件,为下一步工业化生产褐藻胶裂解酶提供理论和实践基础。本研究主要研究结果如下:1.褐藻胶裂解酶高活性菌株的筛选、鉴定及酶活特性分析。本研究对前期分离的6株可分解海带的菌株进行了褐藻胶裂解酶酶活的测定,筛选得到了一株褐藻胶裂解酶酶活最高的菌株,命名为1e,酶活可达236 U/mg-protein,其活性远高于其他菌株且该酶为胞外酶。经过16S r DNA细菌鉴定,1e属于微小杆菌属（Exiguobacterium）,革兰氏染色为阳性菌。对其进行生长条件优化,发现该菌种在1.0%Na Cl浓度的LB培养基中28℃,180 rpm震荡培养,生长状况较好。使用1e菌株的发酵液上清对褐藻胶裂解酶酶活特性进行分析,发现酶活的最适温度为40℃,最适p H 6.0,在该条件下测定的酶活为399.3 U/mg-protein,与未优化前的酶活相比提高1.7倍。2.微小杆菌的全基因组测序和褐藻胶裂解酶基因克隆。提取1e菌的基因组DNA,进行全基因组测序,通过注释获得3条不同的褐藻胶裂解酶基因序列信息,根据编号分别命名为Ebalg660、Ebalg664、Ebalg665。在Gene Bank中通过BLAST分析发现,1e与菌株Exiguobacterium sp.PBE（NCBI序列号:CP065134.1）同源性高达99.94%;这三条褐藻胶裂解酶基因的核酸序列与Exiguobacterium sp.HVEsp1中相应的褐藻胶裂解酶基因序列同源性极高,相似性分别高达99.42%、98.85%、97.97%。3.大肠杆菌Ebalg过表达工程菌构建及产酶分析。分别设计Ebalg660、Ebalg664、Ebalg665基因的上下游引物,以微小杆菌基因组DNA为模板,成功扩增出这三条褐藻胶裂解酶基因。利用同源重组技术将这三种目的基因插入大肠杆菌表达载体p ET-30a,并转化宿主菌BL21（DE3）,经测序验证,最终筛选出Ebalg660、Ebalg664、Ebalg665三种过表达工程菌。分别对这些工程菌的产酶条件进行确定,结果显示,三种Ebalg过表达工程菌在37℃,200 rpm震荡培养至OD值为0.6时,加入IPTG进行Ebalg表达诱导,并在16℃,继续200 rpm震荡培养22 h,能产生相应的重组蛋白。然而这三种工程菌产生的重组蛋白在在宿主菌中折叠异常,多数重组蛋白形成无活性的不溶性包涵体,少数以有活性的可溶性形式存在。对三种重组蛋白进行酶活的测定后,发现Ebalg664基因产重组蛋白的酶活性较高,故选择Ebalg664基因进行下一步毕赤酵母工程菌的构建。4.毕赤酵母Ebalg过表达工程菌构建及产酶分析。经过密码子优化,构建了p PICZa A-Ebalg664毕赤酵母高效表达质粒,通过电转将线性化质粒p PICZa A-Ebalg664插入毕赤酵母X33基因组中,并经甲醇诱导表达重组蛋白。我们对构建的毕赤酵母工程菌进行产酶测定。结果显示,Ebalg664能在宿主菌中正常转录,而且重组蛋白在发酵液上清中含量较高,重组酶的酶活高达8840 U/m L,单位酶活可达1306.5 U/mg-protein,说明Ebalg664不仅在毕赤酵母中正常转录,而且合成的重组蛋白能分泌到胞外,并保持正常酶活。对毕赤酵母工程菌中的重组酶进行酶学性质的分析,发现重组酶在30℃-50℃及p H 3.0-7.0条件下,酶活相对稳定,最适反应温度为40℃,最适p H为6.0;不同离子对重组酶酶活的影响较大,Cu2+、Co2+对Alg664的酶活性有促进作用而Mg2+、Fe3+则有明显的抑制作用;另外,EDTA对重组酶的酶活并无显著的增强或减弱作用。综上,从腐烂海带中分离的微小杆菌具有较高的褐藻胶裂解酶活性,而且基因组中含有三条褐藻胶裂解酶基因。重组褐藻胶裂解酶在大肠杆菌和毕赤酵母中均可表达,但在大肠杆菌宿主菌中主要以不溶性包涵体形式存在,活性很低。然而在毕赤酵母中基因Ebalg664表达正常,并能向胞外分泌活性较高的重组褐藻胶裂解酶,以方便后续的酶的应用或纯化。另外,对重组酶进行酶学性质分析,确定了它的最佳反应温度和p H条件,并且明确了几种常见金属离子对其活性的影响。这些结果将为工业化生产和使用褐藻胶裂解酶提供参考。