【摘 要】
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目的研究T细胞与树突状细胞成熟分化在缺血再灌注AKI中的的相互作用,以及在DIPC中起到的保护作用的机制;并探讨在条件性剔除CD11c+DCs的转基因小鼠中,DIPC是否仍能对急性肾脏IRI产生保护作用,以及其相关的免疫细胞的变化;从而为DCs成为治疗缺血再灌注AKI的潜在靶点提供理论依据。方法1.构建野生型小鼠IRI/DIPC模型,WT雄性小鼠分3组:（1）假手术组（SHAM+SHAM组）;（2
【基金项目】
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国家自然科学基金81860129；
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目的研究T细胞与树突状细胞成熟分化在缺血再灌注AKI中的的相互作用,以及在DIPC中起到的保护作用的机制;并探讨在条件性剔除CD11c+DCs的转基因小鼠中,DIPC是否仍能对急性肾脏IRI产生保护作用,以及其相关的免疫细胞的变化;从而为DCs成为治疗缺血再灌注AKI的潜在靶点提供理论依据。方法1.构建野生型小鼠IRI/DIPC模型,WT雄性小鼠分3组:（1）假手术组（SHAM+SHAM组）;（2）缺血再灌注损伤组（SHAM+IR组）;（3）晚期缺血预适应组（DIPC+IR组）。通过血清肌酐水平、肾脏病理变化验证DIPC的保护作用;2.研究野生型小鼠中DIPC保护作用与DCs成熟度和T细胞分化比例之间的关系:应用流式细胞术分析各组小鼠中DCs和T细胞的表型变化及数量比例;Western Blotting法检测各组小鼠肾脏中CCR7表达水平;免疫组化法检测CD11c+树突状细胞在肾脏中的表达变化;SOD、MDA试剂盒检测各组小鼠氧化应激水平变化;小鼠血清中各类细胞因子（如IL-10、IFN-γ、TNF等）用CBA检测;ELISA法检测小鼠肾脏中炎症因子（IL-10、TNF-α）的水平变化;3.应用普通PCR及流式细胞术筛选及鉴定条件性剔除CD11c+DCs的DTR小鼠;并验证白喉毒素（DT）适宜浓度、作用时间及药物毒性,实验分3组:（1）WT鼠腹腔注射DT组（WT+DT组）;（2）DTR鼠腹腔注射PBS组（DTR+PBS组,）;（3）DTR鼠腹腔注射DT组（DTR+DT组）;4.研究DTR小鼠DIPC后DCs和T细胞之间的关系。构建DTR小鼠的IRI/DIPC模型,将雄性DTR小鼠分4组,均在肾脏损伤手术前16h腹腔注射DT或对照PBS:（1）注射白喉毒素的假手术组（DT+SHAM+SHAM组）;（2）注射白喉毒素的肾脏缺血再灌注肾损伤组（DT+SHAM+IR组）;（3）注射白喉毒素的晚期缺血预适应组（DT+DIPC+IR组）;（4）注射PBS的晚期缺血预适应对照组（PBS+DIPC+IR组）;当CD11c+DCs被剔除后,通过血清肌酐水平、肾脏病理变化验证DIPC发挥的作用;应用流式细胞术分析各组小鼠中DCs和T细胞的表型变化及数量比例,并通过WB、氧化应激、炎症因子检测进一步观察DCs缺失后,DIPC与肾损伤程度以及Tregs之间的关系;5.研究不同培养条件下成熟/未成熟DCs对HK-2细胞的作用影响:分别在正常氧、缺氧复氧条件下（1）单独培养HK-2细胞（2）共培养成熟/未成熟DCs和HK-2细胞,应用流式细胞术、免疫荧光法检测HK-2细胞凋亡、坏死水平。结果1.成功构建肾脏IRI/DIPC模型,DIPC可以明显减轻肾脏IRI后的肌酐水平和病理损伤程度;2.DIPC可以抑制肾脏的炎症细胞聚集,抑制DCs的成熟分化以及其趋化能力,并启动外周免疫器官的免疫作用,提高肾脏组织的Tregs比例;还可以减轻肾脏IRI后的氧化应激水平,提高抑炎因子IL-4的表达水平;3.DTR转基因小鼠模型构建成功。DT梯度浓度及梯度作用时间探索后,发现腹腔注射16ng/g（鼠重）DT后16h可明显降低小鼠脾脏、肾脏中的CD11c+细胞比例,且不对小鼠造成药物性肾损伤;4.注射了DT的DTR小鼠DCs被剔除后,DIPC失去了作用靶点,其对肾脏IR后的功能及组织学保护作用减弱,对炎症细胞聚集的抑制作用减弱,对DCs成熟、趋化能力的抑制以及对Tregs的募集作用明显被削弱,减轻肾IRI后氧化应激水平的作用也被削弱,抑炎因子表达水平降低;5.HK-2细胞缺氧复氧模型构建成功,im DCs、m DCs分离培养成功。H/R HK-2与im DCs/m DCs共培养时,与H/R HK-2细胞相比,细胞凋亡率、坏死率显著降低,其中与im DCs共培养时凋亡、坏死率下降更为明显。结论1.DIPC可能是通过作用于DCs,影响其的分型转化,抑制其分化成熟,进而刺激T细胞向Tregs分化,从而产生肾脏IRI的保护作用;2.当DCs被剔除后,从肌酐水平、氧化应激水平变化、病理形态改变以及募集Tregs等方面来看,DIPC对于缺血再灌注AKI的保护作用明显削弱;3.DCs在肾脏IRI以及DIPC中发挥着至关重要的作用,但具体作用机制与其在不同的疾病进程及局部微环境中有所差别。
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