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神经小胶质细胞作为大脑中的巨噬细胞,是中枢神经系统(CNS)免疫反应的关键参与者之一。它们分布在整个中枢神经系统中,约占大脑中总胶质细胞数量的10%～20%。它最早在1932年由Piodel Rio Hortega提出。自从小胶质细胞被发现以来,它的起源、特征、作用、生理和病理状态一直被研究人员不知疲倦地辩论。然而,普遍的共识是,小胶质细胞来源于原始卵黄囊巨噬细胞,其迁移到大脑并在早期胚胎发育过程中成为固定细胞。在健康的成熟大脑中且在正常的生理状况下,神经小胶质细胞显示监视行为,其形态随微环境改变而改变。小胶质细胞分为两种状态,静息态和激活态,激活态又可分为M1型和M2型,形态学上即“分枝”和“变形虫”。M1型的小胶质细胞可促进炎症因子的释放,对神经细胞产生细胞毒性作用。M2型的小胶质细胞能够释放抗炎因子,对神经细胞有保护作用。这些细胞对脑微环境的变化敏感,一旦体内平衡发生改变,细胞就会呈现激活状态,这最终会导致细胞功能、基因以及蛋白质表达的改变,也会导致一系列因子的释放,包括细胞因子(白细胞介素、肿瘤坏死因子)、趋化因子(MCP-1)、兴奋性神经递质(谷氨酸)、补体因子、前列腺素、活性氧和氮等。因此抑制神经小胶质细胞的过度激活(M1型),减少细胞炎症因子的产生已成为减轻神经炎症反应中的重要一环。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是由肠道L细胞分泌的一种多肽激素,它不仅是临床上常用的降糖药,而且对神经细胞有营养和保护作用。小胶质细胞上有GLP-1受体(GLP-1R),GLP-1类似物可通过与细胞膜表面的GLP-1R结合发挥作用。然而。目前GLP—1类似物利拉鲁肽的神经保护作用的具体机制尚不清楚。因此阐明其机制是利拉鲁肽作为神经保护治疗药物的前提和研究重点。Notch信号通路是调控胚胎发育的重要通路,它可以调控单核巨噬细胞的极化,单核巨噬细胞过度激活会导致M1型细胞增多,而小胶质细胞功能类似于单核巨噬细胞,也可由Notch信号通路调控。因此我们推断GLP-1类似物利拉鲁肽可通过Notch信号通路调节原代小胶质细胞的激活。本课题利用新生24 h SD大鼠提取的原代小胶质细胞激活作为细胞模型,来探讨利拉鲁肽通过Notch信号通路调节下丘脑小胶质细胞激活的机制。我将从三个部分介绍本课题:第一部分:原代神经小胶质细胞培养方法的初探。方法:取出生24 h的SD大鼠的脑皮层组织,胰酶消化成单个细胞、培养,待细胞长满培养瓶后,用力拍打培养瓶3 min,离心并收集沉淀,加入新培养液再培养,采用免疫荧光法鉴定其纯度。结果:共聚焦显微镜鉴定小胶质细胞纯度可达到96.85%。第二部分:脂多糖诱导的细胞激活模型及利拉鲁肽的细胞毒性作用。方法:脂多糖(LPS)处理的小胶质细胞分为5组:对照组、1ng/ml LPS、10ng/ml LPS、100ng/ml LPS,1000ng/ml LPS。利拉鲁肽(Lira)处理的LPS诱导的小胶质细胞分为5组:对照组、100nMLira、10ng/ml LPS+1 nM Lira、10ng/ml LPS+10 nM Lira、10ng/ml LPS+100nM Lira。用 CCK-8试剂,通过酶标仪检测LPS以及利拉鲁肽对细胞的毒性。结果:在LPS细胞毒性实验中,100 ng/mL、1000ng/ml脂多糖(LPS)处理24h后,细胞活力分别为(49.13%±9.515%)、(40.60%±6.638%),细胞活力显著降低。而1ng/ml LPS、10ng/mLLPS处理细胞后,活力分别为(113.79%±4.933%)、(89.24%±2.597%),表明其浓度对细胞活力无明显影响。在利拉鲁肽细胞毒性实验中,100 nM利拉鲁肽处理细胞后其细胞活力为(87.62%±5.650%)。在同一种浓度1Ong/ml LPS下,不同浓度的利拉鲁肽处理后细胞活性分别为:1nM(83.17%±5.719%),10 nM(92.36%±6.609%),100 nM(99.72%±5.806%),表明 10ng/ml 脂多糖以及不同浓度的利拉鲁肽处理后细胞活性无明显下降,因此,选择LPS(10ng/ml)诱导的细胞模型以及100nM利拉鲁肽用于以下实验。第三部分:利拉鲁肽通过Notch信号通路调节小胶质细胞激活的机制研究。方法:提纯后细胞分成5组(对照组、LPS组、利拉鲁肽组、LPS+利拉鲁肽组、LPS+DAPT组),酶联接免疫吸附剂测定(Elisa)检测炎症因子(TNF-α、IL-6)的浓度,免疫荧光法定性及半定量检测M1型标记物(iNOS)及 M2 型标记物(Arg1),RT-PCR 和 ELISA 分别分析 Notch-1、Hes-1、CYLD、NF-kB/p65和p38MAPK蛋白浓度和基因水平的表达。结果:在免疫荧光法处理的各组小胶质细胞中,LPS诱导的小胶质细胞中M1型标记物(iNOS)的表达显着增加,M2型标记物(Arg1)表达显著减少。利拉鲁肽和DAPT处理LPS诱导的小胶质细胞抑制了小胶质细胞活化。在Elisa实验中,LPS诱导的小胶质细胞的炎症因子TNF-α和IL-6的产生增加,利拉鲁肽和DAPT处理LPS诱导的小胶质细胞中TNF-α和IL-6的产生减少。在免疫蛋白印迹实验中,LPS诱导的小胶质细胞中的Notch-1、Hes-1、NF-kB/p65和p38MAPK蛋白质水平增加,CYLD的蛋白质水平表达没有显着差异,利拉鲁肽和DAPT处理LPS诱导的小胶质细胞都降低了Notch-1和Hes-1蛋白质水平的表达,且NF-kB/p65和p38MAPK蛋白水平也明显降低,而CYLD蛋白水平增加。荧光定量PCR分析显示结果与免疫蛋白印迹实验相符。结论:本课题通过在体外细胞实验发现LPS诱导的原代小胶质细胞激活时,其Notch信号通路的表达增强,并证实了 GLP-1类似物利拉鲁肽可通过介导Notch信号通路来调节小胶质细胞的活化状态(M1型与M2型之间的转化)以及炎症因子的释放。因此,利拉鲁肽可通过阻断Notch信号通路来抑制小胶质细胞的活化以及炎症反应。