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研究背景:肺癌是全球发病率及死亡率排第一的肿瘤,占肺癌85%的类型为非小细胞性肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)。大多数就诊的非小细胞性肺癌患者在发现时已出现局部肿瘤侵犯血管,及淋巴结和远处转移,丧失了手术机会。分子靶向药物表皮生长因子受体络氨酸激酶抑制剂(Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)的出现给晚期肺癌患者带来了希望,但是EGFR-TKIs仅仅对有基因突变患者有效,且绝大数在使用后出现耐药。因此对EGFR-TKIs耐药的机制研究及如何解决耐药问题成为国内外研究者关注的热点。近期的研究发现在EGFR-TKIs耐药的患者中22%的患者出现有间质-表皮转化基因(mesenchymal–epidermal transition,MET)的扩增,及Wnt/β-catenin信号通路的激活,且两者呈正调节关系。S-腺苷甲硫氨酸(SAdenosylmethionine,SAM)作为膳食补充剂和细胞甲基化试剂在多种肿瘤中显示有抗癌作用,并且在肝癌和结肠癌中SAM及自然代谢产物(5-methylthioadenosine,MTA)可抑制β-catenin信号通路及其靶向基因的表达。在肝癌中已证实SAM可通过阻断MET的配体肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)抑制肝细胞增殖。表观遗传学在肺癌发病机制中极为重要,而SAM作为细胞DNA甲基化的首要供体及细胞甲基化试剂在肺癌中的研究却非常少。基于SAM的抗癌作用及对MET和β-catenin信号通路的可能影响,其在肺癌中的应用可为晚期肺癌患者特别是EGFR-TKIs耐药患者提供更多治疗策略。【目的】通过观测SAM及其代谢物MTA在NSCLC离体细胞株及在体裸鼠皮下肿瘤中对肿瘤的增殖,侵袭,转移的作用。同时检测MET,EGFR,β-catenin及其靶向基因的表达和探寻其可能作用机制,为SAM在NSCLC中靶向治疗提供分子生物学理论基础。【方法】1.通过SAM、MTA干预A549、H292细胞株,采用软琼脂克隆形成实验,MTT细胞增殖实验、侵袭实验、划痕实验、裸鼠皮下成瘤实验,研究SAM及其代谢物MTA对NSCLC生物学功能的影响。2.采用Real-Time PCR、Western Blot,免疫荧光法检测SAM、MTA干预NSCLC细胞株A549、H292后,EGFR、EGFR靶向基因IL-8、MET、β-catenin、β-catenin靶向基因CCND1、c-MYC等基因的m RNA和蛋白表达水平。3.采用Real-Time PCR、Western Blot法检测,对SAM合成关键酶(Methionine Adenosyltransferase,MATs)的编码基因MAT1A过表达,酶学点突变,MAT2A,MATB过表达及si RNA沉默后,EGFR、EGFR下游调节基因:IL-8,MET、β-catenin、β-catenin靶向调节基因:CCND1、c-MYC等的m RNA和蛋白表达水平,进一步验证SAM可能通过的表观遗传学途径作用。4.通过双荧光素酶分析SAM、MTA可能作用于目标基因启动子序列的靶向位点,从转录调控水平分析其可能作用机制。5.通过在对同样上皮细胞来源的Hep3B细胞株中转染MAT1A过表达质粒及si RNA沉默后,造成内源性高SAM表达和低SAM表达后,使用肿瘤转移基因芯片,进一步研究肿瘤转移相关基因的表达。【结果】1.SAM及其代谢产物MTA可显著抑制A549细胞株的克隆形成;可抑制A549,H292细胞株的细胞增殖和侵袭转移;同时对裸鼠SAM灌胃可显著抑制其皮下肿瘤的生长。2.SAM,MTA可降低MET、EGFR,CCND1、c-MYC的m RNA和蛋白表达水平,可降低β-catenin的蛋白表达水平。3.A549,H292中过表达MAT1A可同样明显抑制MET、EGFR,β-catenin,CCND1、c-MYC、IL-8的m RNA或蛋白表达水平,对其酶学点突变后,其作用效果消失。4.过表达MAT2A,MAT2B可增加MET,EGFR,CCND1的m RNA表达水平,而si RNA沉默MAT2A,MAT2B后降低其表达水平。5.SAM,MTA可显著降低AP-1(7×ATGAGTCAT)启动子活性;及对IL-8启动子AP-1序列突变后活性下降;推测其可能通过抑制AP-1启动子活性抑制目标靶基因转录表达。6.在Hep3B细胞中对MAT1A过表达后内源性SAM升高后发现,与肿瘤转移相关的76个基因中有64个基因出现表达下降,其中包括有HGF/MET基因的表达。【结论】1.SAM,MTA在NSCLC中有抑制肿瘤增殖,侵袭和转移的效果。2.SAM,MTA可抑制MET,EGFR,EGFR下游靶基因IL-8表达及β-catenin及靶向调节基因CCND1,c-MYC的表达。3.SAM,MTA发挥抗癌作用可能通过表观遗传学途径,及同时有可能作用于MET和IL-8启动子AP-1位点,转录水平调节目标靶基因的表达。4.MAT1A在NSCLC中为抗癌基因,MAT2A,MAT2B为促癌基因。